摘要：伯氏疟原虫作为疟疾研究的重要模式生物，其基因操作技术对深入探究疟原虫生物学特性、致病机制及抗疟药物研发至关重要。电穿孔转染是将外源核酸导入疟原虫的常用方法，但现有方案仍存在转染效率不稳定、细胞损伤较大等局限。本文聚焦于对伯氏疟原虫电穿孔转染方案的优化，通过系统地调整电穿孔参数、优化转染试剂配方、改进疟原虫预处理方式以及完善转染后培养条件，显著提升了转染效率，降低了疟原虫死亡率，为疟原虫基因功能研究提供了更稳健、高效的技术手段，有望助力疟疾领域科研工作取得更多突破性进展。

一、引言

疟疾是全球严重的公共卫生问题，每年导致数百万人口患病、数十万人死亡，严重威胁人类健康，尤其在热带和亚热带地区肆虐。伯氏疟原虫（Plasmodium berghei）因易于在实验室小鼠模型中传代培养、生命周期相对清晰明确，成为疟原虫研究领域的经典模式生物，为理解疟原虫基本生物学过程、致病机理以及筛选潜在抗疟药物靶点等工作提供了关键支撑。

基因转染技术能人为地将外源基因或核酸片段导入疟原虫，借此干扰或补充其固有基因功能，是揭示疟原虫基因作用、解析复杂信号通路的 “金钥匙”。电穿孔转染基于高压电脉冲短暂破坏细胞膜磷脂双分子层结构，形成可逆性纳米级孔隙，促使外源核酸顺势进入细胞内部。然而，传统伯氏疟原虫电穿孔转染方案面临诸多困境，诸如转染效率在不同批次实验间波动明显，过高电压易引发疟原虫不可逆损伤、活力锐减，转染后疟原虫生长恢复缓慢等，这些问题犹如绊脚石，限制了对疟原虫深入细致的遗传学剖析。因此，对电穿孔转染方案开展进阶优化，具有迫切且重要的现实意义，有望突破现有技术瓶颈，为疟原虫研究注入活力。

二、材料与方法

（一）实验材料

1. 疟原虫株与宿主动物：采用实验室长时间稳定传代培养的伯氏疟原虫 ANKA 株，以 6 - 8 周龄雌性 BALB/c 小鼠为寄生宿主，通过腹腔注射感染疟原虫，待小鼠原虫血症达到适宜水平（5% - 10%）时，采集血液分离疟原虫用于后续实验。

2. 主要试剂：RPMI 1640 完全培养基（添加 10% 胎牛血清、1% 青霉素 - 链霉素混合液、0.5% 次黄嘌呤），作为疟原虫基础培养介质；电转染缓冲液（选用商业化低离子强度、含特定浓度蔗糖与甘露醇的缓冲体系，经预实验验证对疟原虫渗透压平衡维护效果良好）；外源转染质粒（携带绿色荧光蛋白基因 GFP，作为转染成功可视化标记，构建骨架基于疟原虫偏好密码子优化、具备高效启动子驱动）；核酸染剂（如 SYBR Green I，用于评估转染后疟原虫核酸含量与完整性）；台盼蓝，区分活死疟原虫以计算存活率。

3. 仪器设备：电穿孔仪（具备精确电压、电容、电阻调控功能，可预设多种脉冲程序），血细胞计数板，离心机（可适配微量离心管，具备制冷功能保障样品稳定性），荧光显微镜（装备高分辨率成像系统、适配 GFP 激发与发射滤光片）。

（二）实验方法

1. 疟原虫预处理：从感染小鼠心脏采血，抗凝处理后低速离心（500g，5min）分离红细胞层，用预冷的不完全 RPMI 1640 培养基温和洗涤 3 次，去除血浆成分及宿主免疫细胞残留。随后将疟原虫感染红细胞（pRBCs）重悬于电转染缓冲液，调整疟原虫密度至 1×10⁸个 /mL，并添加适量蛋白酶抑制剂混合物，冰浴孵育 30min，适度抑制疟原虫表面膜蛋白过度活跃，降低电穿孔对细胞膜结构的额外破坏风险。

2. 电穿孔转染操作：将预处理后的 pRBCs 与外源质粒 DNA（按 10:1 质量比，经预优化比例设定）轻柔混合，转移至预冷的电穿孔 cuvette（0.2cm 电极间距，确保电场均匀分布），迅速置于电穿孔仪样品槽内。设置电压梯度范围（从 200V - 400V，以 50V 步长递增）、电容固定为 25μF、电阻 500Ω，给予单次方形电脉冲刺激，脉冲时长控制在 5 - 10ms，操作全程在冰浴环境下执行，减少热效应引发的疟原虫损伤。

3. 转染后培养复苏：电穿孔结束后，立即将样品转移至含预热 RPMI 1640 完全培养基的离心管，轻柔混匀，低速离心（300g，3min）去除电转染缓冲液残留，重悬沉淀后转接至细胞培养板，置于 37°C、5% CO₂饱和湿度培养箱孵育。培养初期 6 - 8h，添加适量抗氧化剂（如谷胱甘肽）与细胞膜修复促进剂（胆固醇 - 磷脂复合物），助力疟原虫细胞膜修复、缓解氧化应激损伤，每隔 2h 取样，用荧光显微镜监测 GFP 表达情况、台盼蓝染色统计疟原虫存活率。

三、结果与讨论

（一）转染效率评估

通过对不同电压参数下转染后疟原虫 GFP 阳性率统计分析发现，当电压设置在 300V 时，转染后 24h GFP 阳性疟原虫占比达峰值（约 35%），相较于基础方案（200V 下仅 15% 左右）提升显著。在低电压区间（200V - 250V），因电脉冲能量不足，孔隙形成效率低，外源 DNA 进入受阻；而高电压（350V - 400V）虽孔隙增多，但对疟原虫损伤严重，存活疟原虫锐减且部分细胞膜修复失败，难以稳定表达外源基因，致使转染效率不升反降，表明适度电压对平衡转染效果与疟原虫生存至关重要。

（二）疟原虫存活率分析

台盼蓝染色结果显示，经优化预处理及转染后培养条件，疟原虫在转染后 6h 存活率从传统方案的不足 60% 提升至 80% 以上，且后续 24h 内维持相对稳定，细胞活力增强为外源基因有效整合、表达提供良好细胞内环境。冰浴孵育与添加保护剂有效缓冲电脉冲冲击、减轻氧化损伤，避免疟原虫因应激死亡，保障了转染操作后疟原虫群体规模与活性状态。

（三）稳定性验证

重复实验批次（n = 5）数据表明，优化方案转染效率标准差控制在 3% 以内，疟原虫存活率波动范围小于 5%，相较于传统方案（转染效率标准差达 8%，存活率波动超 10%）稳定性大幅提升，彰显新方案可靠、可重复性强，为不同实验室开展疟原虫基因研究奠定坚实方法基础，减少因实验技术差异导致的数据偏差与结论分歧。

四、优化方案优势与应用前景

（一）技术优势

本优化方案精确把控电穿孔关键参数、协同改良预处理与培养环节，实现转染效率与疟原虫存活率 “双升”，攻克传统方法效率低、不稳定、损伤大 “顽疾”。对电压精细调校契合疟原虫细胞膜电学特性，保护剂运用契合细胞应激修复生理需求，各环节相辅相成、丝丝入扣，形成高效、稳健转染体系。

（二）应用拓展

在基础科研层面，助力深度解析伯氏疟原虫基因功能，通过定点突变、基因敲除 / 敲入等遗传操作，绘制精细基因调控网络，阐释发育、侵染宿主等生命进程分子机制；在药物研发领域，方便构建抗性筛选模型、评价新药靶点有效性，加速抗疟药物从实验室到临床转化进程，为全球疟疾防控事业添砖加瓦，开拓疟原虫研究新天地。

五、结论

本文针对伯氏疟原虫电穿孔转染方案系统优化，经严谨实验验证，在转染效率、疟原虫存活及稳定性多维度成效斐然，为疟原虫基因操作开辟新径。后续研究可聚焦于拓展适配不同疟原虫株与外源核酸类型，持续深挖技术潜能，凭借更精良基因工具，深挖疟原虫秘密，向着攻克疟疾目标稳步迈进。