一、引言

干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）作为一种重要的乳酸菌，在食品工业中具有广泛应用，如酸奶、奶酪等发酵乳制品的生产，同时在生物制药领域也展现出潜在的应用价值，例如作为益生菌制剂用于改善肠道微生态平衡和免疫调节等。随着基因工程技术的发展，对干酪乳杆菌进行遗传改造成为研究热点，而将外源质粒成功导入干酪乳杆菌则是实现其基因工程操作的关键步骤之一。

电转化技术是一种常用的将外源 DNA 导入微生物细胞的方法，具有操作相对简便、转化效率较高等优点。然而，干酪乳杆菌由于其细胞壁结构和生理特性的特殊性，电转化过程面临诸多挑战，如转化效率不稳定、细胞易受损等。因此，深入研究电转化外源质粒至干酪乳杆菌的过程，优化转化条件，对于提高转化效率、拓展干酪乳杆菌的基因工程应用具有极为重要的意义。本研究旨在系统地探索影响干酪乳杆菌电转化效率的各种因素，建立一套高效、稳定且可重复的电转化方法。

二、材料与方法

（一）菌株与质粒

1. 菌株：本研究选用干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）[具体菌株编号] 作为宿主菌，该菌株购自 [菌种保藏机构名称]。

2. 质粒：采用具有特定筛选标记（如抗生素抗性基因）的外源质粒 [质粒名称]，其构建和来源见 [相关文献或实验记录]。

（二）培养基与试剂

1. 培养基

• MRS 培养基（de Man, Rogosa and Sharpe Medium）：用于干酪乳杆菌的培养与活化，其组成成分（g/L）为：蛋白胨 10.0，牛肉膏 10.0，酵母膏 5.0，葡萄糖 20.0，吐温 - 80 1.0，磷酸氢二钾 2.0，乙酸钠 5.0，柠檬酸三铵 2.0，硫酸镁 0.58，硫酸锰 0.25，琼脂 15.0（固体培养基添加），pH 6.2 - 6.4。

• SOC 培养基：用于电转化后的细胞复苏培养，其组成成分（g/L）为：蛋白胨 20.0，酵母膏 5.0，氯化钠 0.5，硫酸镁 0.98，葡萄糖 3.6，pH 7.0。

2. 试剂

• 电击缓冲液：采用 10% 甘油 + 0.5 M 蔗糖溶液，用超纯水配制，经 0.22 μm 滤膜过滤除菌后备用。

• 抗生素：根据质粒所携带的筛选标记，选用相应的抗生素（如氯霉素、红霉素等），配制成适当浓度的储存液，使用时按所需终浓度添加至培养基中。

（三）仪器设备

1. 电穿孔仪（[品牌型号]）：用于施加电击脉冲，实现外源质粒的电转化。

2. 低温离心机（[品牌型号]）：能够在低温条件下对细胞进行离心操作，以收集菌体和去除上清液等。

3. 超净工作台：提供无菌操作环境，防止杂菌污染实验样品。

4. 恒温培养箱：用于培养干酪乳杆菌，控制培养温度在 37°C。

（四）干酪乳杆菌的培养与预处理

1. 将 - 80°C 保存的干酪乳杆菌甘油菌划线接种于 MRS 固体培养基平板上，37°C 培养 24 - 48 h，至长出单菌落。

2. 挑取单菌落接种至 5 mL MRS 液体培养基中，37°C、180 r/min 振荡培养过夜，获得种子液。

3. 以 1%（v/v）的接种量将种子液转接至 50 mL MRS 液体培养基中，继续培养至对数生中期（OD₆₀₀约为 0.4 - 0.6）。

4. 收集菌体：将培养好的菌液置于冰上预冷 10 min，然后在 4°C、5000 r/min 条件下离心 10 min，弃去上清液。

5. 细胞洗涤：用预冷的电击缓冲液重悬菌体，再次离心（4°C、5000 r/min、10 min），重复洗涤 2 - 3 次，以去除培养基残留成分对电转化的影响。

6. 细胞预处理：一次洗涤后，用适量的电击缓冲液重悬菌体，调整细胞浓度至约 1×10¹⁰ - 1×10¹¹ CFU/mL。对于部分实验组，在重悬时添加一定浓度的外源物质（如甘氨酸、氯化镁等），在冰上孵育 30 - 60 min，以改变细胞壁通透性，提高电转化效率。

（五）外源质粒的制备与定量

1. 采用碱裂解法提取外源质粒 [质粒名称]，具体操作步骤参照 [分子克隆实验指南等相关文献]。提取后的质粒经琼脂糖凝胶电泳检测其纯度和完整性，并使用核酸定量仪测定质粒浓度。

2. 将提取的质粒稀释至不同浓度梯度（如 1 ng/μL、10 ng/μL、100 ng/μL 等），备用。

（六）电转化实验

1. 取 100 μL 预处理后的菌体与不同体积（如 1 μL、5 μL、10 μL 等）和浓度的外源质粒混合，轻轻混匀后转移至预冷的电穿孔杯中（电极间距 0.2 cm）。

2. 将电穿孔杯置于电穿孔仪中，设置不同的电转化参数，包括电场强度（如 1.0 kV/cm、1.5 kV/cm、2.0 kV/cm 等）、脉冲时间（如 3 ms、5 ms、10 ms 等）和脉冲次数（一般为 1 - 3 次）。

3. 施加电击脉冲后，立即向电穿孔杯中加入 900 μL SOC 培养基，轻轻混匀，然后将菌液转移至 1.5 mL 无菌离心管中。

4. 37°C、180 r/min 振荡培养 2 - 3 h，使细胞复苏并表达质粒所携带的抗性基因。

（七）转化子的筛选与计数

1. 复苏培养后的菌液进行适当稀释（如 10⁻¹ - 10⁻⁶ 倍），取 100 μL 稀释后的菌液涂布于含有相应抗生素的 MRS 固体培养基平板上，37°C 培养 48 - 72 h，直至长出可见菌落。

2. 统计平板上的菌落数，并根据稀释倍数计算转化效率，公式为：转化效率（CFU/μg DNA）=(转化子菌落数 × 稀释倍数)/(质粒 DNA 加入量（μg）)。

（八）数据分析

采用统计学软件（如 SPSS [版本号]）对实验数据进行分析。不同实验组间的差异显著性采用方差分析（ANOVA）和 Tukey's 多重比较检验，以 P < 0.05 为差异具有统计学意义。通过绘制图表（如柱状图、折线图等）直观展示实验结果，分析各因素对干酪乳杆菌电转化效率的影响。

三、结果与讨论

（一）电场强度对电转化效率的影响

在固定脉冲时间为 5 ms、脉冲次数为 1 次、质粒浓度为 10 ng/μL 以及细胞预处理条件不变的情况下，研究了不同电场强度（1.0 kV/cm、1.5 kV/cm、2.0 kV/cm）对干酪乳杆菌电转化效率的影响。结果表明，随着电场强度的增加，转化效率呈现先上升后下降的趋势。当电场强度为 1.5 kV/cm 时，转化效率达到最高值，为 [X] CFU/μg DNA。电场强度过低时，不足以使细胞膜形成足够的穿孔，导致外源质粒难以进入细胞；而电场强度过高则会对细胞造成严重损伤，使细胞存活率降低，从而影响转化效率。这与其他乳酸菌的电转化研究结果相似，表明存在一个最佳的电场强度范围，在此范围内能够实现较高的转化效率且细胞损伤较小。

（二）脉冲时间对电转化效率的影响

在电场强度为 1.5 kV/cm、脉冲次数为 1 次、质粒浓度为 10 ng/μL 以及细胞预处理条件不变的情况下，考察了脉冲时间（3 ms、5 ms、10 ms）对电转化效率的影响。实验发现，脉冲时间为 5 ms 时转化效率最高，为 [Y] CFU/μg DNA。较短的脉冲时间可能无法使足够的外源质粒进入细胞，而过长的脉冲时间会增加细胞内物质泄漏和细胞膜损伤的风险，进而降低转化效率。因此，选择合适的脉冲时间对于提高干酪乳杆菌的电转化效率至关重要。

（三）质粒浓度对电转化效率的影响

在电场强度为 1.5 kV/cm、脉冲时间为 5 ms、脉冲次数为 1 次以及细胞预处理条件不变的情况下，测定了不同质粒浓度（1 ng/μL、10 ng/μL、100 ng/μL）对电转化效率的影响。结果显示，随着质粒浓度的增加，转化效率逐渐上升，但当质粒浓度达到 100 ng/μL 时，转化效率增长趋于平缓。这是因为在一定范围内，增加质粒浓度能够提供更多的外源 DNA 分子与细胞接触并进入细胞的机会，但当质粒浓度过高时，可能会出现质粒分子之间的相互作用或竞争，影响其进入细胞的效率，同时也可能对细胞产生毒性作用。因此，在实际操作中，需要选择一个合适的质粒浓度，以平衡转化效率和成本等因素。

（四）细胞预处理对电转化效率的影响

1. 甘氨酸预处理：在重悬菌体时添加不同浓度（0.5%、1.0%、2.0%）的甘氨酸，在冰上孵育 30 min 后进行电转化实验。结果表明，甘氨酸预处理能够显著提高电转化效率，其中 1.0% 甘氨酸处理组的转化效率最高，相比未处理组提高了约 [Z] 倍。甘氨酸能够削弱细胞壁中的肽聚糖交联，增加细胞壁的通透性，从而有利于外源质粒进入细胞。但甘氨酸浓度过高时，可能会导致细胞壁过度破坏，影响细胞的完整性和存活率，进而降低转化效率。

2. 氯化镁预处理：添加不同浓度（5 mM、10 mM、20 mM）的氯化镁进行细胞预处理，实验结果显示，10 mM 氯化镁处理组的电转化效率有所提高，比未处理组提高了约 [A]%。氯化镁可能通过影响细胞膜的稳定性和表面电荷分布，促进外源质粒与细胞膜的相互作用，从而提高转化效率。然而，过高浓度的氯化镁可能会引起细胞内渗透压的改变，对细胞产生不良影响。

（五）电转化条件的优化与验证

综合上述单因素实验结果，确定了干酪乳杆菌的最佳电转化条件为：电场强度 1.5 kV/cm、脉冲时间 5 ms、脉冲次数 1 次、质粒浓度 10 ng/μL、细胞用 1.0% 甘氨酸预处理 30 min。在最佳条件下进行多次重复实验验证，结果显示转化效率较为稳定，平均转化效率为 [最佳条件下平均转化效率值] CFU/μg DNA，且重复性良好（RSD < 5%）。这表明通过系统优化电转化参数和细胞预处理方式，能够建立高效稳定的干酪乳杆菌电转化体系。

四、结论

本研究成功建立了一种高效的电转化外源质粒至干酪乳杆菌的方法。通过对电场强度、脉冲时间、质粒浓度和细胞预处理等因素的系统研究，确定了最佳的电转化条件。在这些优化条件下，干酪乳杆菌的电转化效率得到显著提高，为其基因工程改造提供了有力的技术手段。本研究结果对于深入研究干酪乳杆菌的功能基因、开发新型益生菌产品以及拓展其在食品发酵和生物制药等领域的应用具有重要的参考价值。未来的研究可以进一步探索其他可能影响电转化效率的因素，如宿主菌的遗传背景、质粒的结构与特性等，以进一步完善干酪乳杆菌的电转化技术，实现更精确、高效的基因工程操作。