近年来，面向生物组织大深度光学成像的方法不断发展，其中包括光学相干层析、多光子成像和自适应光学等。

浙江大学光电科学与工程学院现代光学仪器国家重点实验室的文志博团队发表文章，介绍了浙江大学光电科学与工程学院近年来在生物组织大深度定量光学成像方面的一系列重要进展。包括光学相干层析结构与功能成像、基于三光子荧光显微的大深度脑血管成像和新型的畸变误差波校正方法等，并进一步概述了如何对上述方法获取的光学图像实施定量表征以获取生物组织的生理与病理信息。

生物组织大深度成像方法

光学相干层析（OCT）

OCT基于低相干干涉原理工作。光源发出的光经迈克耳孙干涉仪分成参考光和信号光，两束光反射后干涉，干涉光谱经傅里叶变换得到结构图像。在三维成像方面，通过轴向扫描获取深度分辨信息，横向扫描获二维截面信息，再结合其他扫描模式实现三维成像。

OCT成像原理与三维重构

傅里叶域OCT轴向量程受光谱采样率限制，一般为1-5mm，不过研究人员不断创新。例如Wang等采用虚像相控阵列（VIPA）细分光谱，实现了81.87mm的成像量程。在探头小型化上也有诸多尝试，美国约翰霍普金斯大学用单模光纤（SMF）成像但有局限，韩国国立釜山大学引入大纤芯光纤（LCF）有改进空间，而浙江大学Ding等提出的基于拉锥光纤的探头性能更优，在1300nm波长下，实现了140μm工作距离、11.5μm横向分辨率和520μm焦深。

输出光束可调控的无透镜探头

OCT可在体获取生物体内组织和器官的三维结构或功能信息，在眼科、皮肤科、神经科学、脑成像和肿瘤学等疾病诊断和监测中广泛应用。

OCTA作为OCT的功能拓展，以红细胞为标记实现毛细血管三维血流灌注可视化，已应用于多个域。同时，众多技术手段不断涌现，如Cheng等建立血流信号统计模型，Guo等提出运动检测方法，Huang等构建信噪比自适应方法，Li等提出改进分类器等。

OCTA原理示意图

ID的渐近关系和生成的OCTA图像

FLS诱导的小鼠视网膜血流动力学响应的在体监测

在血流动力学监测方面，Chen等提出自适应时空核，Deng等实现视网膜神经血管耦合功能成像并加速数据处理，Zhang等实现神经调节微循环动态成像。此外，OCTA还有望用于血糖监测，如Liu等发展的相关技术发现了血液成分衰减系数与血糖浓度的关联。将OCT样品臂小型化与临床内镜通道结合，可用于内部器官早期肿瘤检测，如Yao等利用不同探头在口腔颊黏膜和胆胰管狭窄腔实现血流成像。

基于OCTA的OAC监测及OAC与BGC的相关性

基于ET-MEMS远端扫描探头的颊黏膜OCTA图像

三光子荧光成像

三光子荧光成像具有长波长近红外光激发和高阶非线性光学效应两大特点。近红外光激发波长越长抗散射能力越强，常用 1300nm和1700nm附近窗口，穿透深度理论可达3mm以上。高阶非线性效应使荧光信号局限在焦点处，良好的信号背景比和高空间分辨率，成像深度和分辨率分别可达毫米量和亚微米量。

三光子荧光脑血管、神经元结构和脑功能成像

多种三光子荧光成像应用场景

2013年美国康奈尔大学实现活体小鼠脑神经和脑血管的三光子荧光成像，之后在生物组织大深度成像中广泛应用，包括脑结构和功能成像、荧光寿命成像和光动力治疗等，还涉及小鼠脂肪肝诊断和淋巴系统追踪等域。例如深圳大学团队在星形胶质细胞和小胶质细胞成像上取得成果，以及其他研究人员在不同方面的应用探索。

成像技术一直追求更大深度和更快速度。在增大深度方面，与AO技术结合可矫正像差提高成像质量，如欧洲分子生物学实验室的研究。利用活体组织光透明技术可降低颅骨散射，不同研究人员通过多种方式提升了成像深度。在提高速度方面，美国康奈尔大学通过引入自适应激发光源提升了成像速度，但存在局限，还可通过优化荧光探针亮度进一步提升速度。

自适应光学改善三光子荧光成像深度和成像速度

自适应光学（AO）

AO用于校正波，解决生物样本导致的成像问题。包括直接波探测和间接波探测两种方案，直接波探测常用Shack-Hartmann（SH）传感器等，间接波探测通过观测图像质量指标调整校准器件。AO系统由波探测模块、波校正模块和控制模块组成，波探测模块精度至关重要。

两种AO模式

SH传感器原理图

光学像差校正器

波探测比较

自适应光学（AO）于1953年提出，20世纪70年代末在天文和军用域发展，21世纪转向民用与显微成像系统结合用于生物医学研究。多年来经过不断发展，如美国密歇根大学将其与双光子成像技术结合，美国哈佛大学提出模式法，美国霍华德・休斯医学研究所提出瞳孔分割法等。近年来，深度学习也应用于像差探测和校正，浙江大学Hu提出新型波校正方法，还有其他研究人员提出多种基于深度学习的改进方法。

在培养的幼年叙利亚地鼠肾细胞中

重建了鬼笔环肽标记的肌动蛋白的SIM图像

SRACNet 在共聚焦显微镜上的图像增强性能

光学图像定量表征

纤维状结构空间取向定量表征

空间取向是纤维状结构重要特征，二维取向计算常用傅里叶变换但有局限。近年来三维空间取向计算受关注，如2012年美国伊利诺伊大学香槟分校的研究有改进空间，2015年Liu等提出权重矢量求和法，计算速度更快，可得到像素的二维或三维空间取向。

TSHWS和LSHWS的波传感能力比较

纤维状结构空间取向的定义

基于空间取向，Liu等提出方向方差指标。通过小鼠乳腺癌模型和人体腹膜癌扩散模型研究发现，胶原纤维在正常和肿瘤组织中空间取向不同，肿瘤组织中排列更有序，三维方向方差更小，对癌症研究有重要意义。

纤维状结构空间曲率定量表征

Qian等提出像素的纤维状结构空间曲率定量表征方法。通过图像二值化、计算空间取向、创建计算窗口等步骤得到曲率矩阵，提供像素曲率信息，还可扩展到三维空间。

纤维状结构空间曲率的计算原理图

结合空间取向、方向方差和空间曲率三个指标，对小鼠全身血管进行多参数分析，空间曲率在鼠脑血管和胰腺癌诊断等方面是高灵敏指标。通过对细胞器和细胞骨架研究，发现空间曲率能反映内质网重塑特征，还发现新的内质网生长机制。

纤维状结构直径定量表征

Meng等提出二维和三维直径定量表征方法。通过二值化处理、计算距离、执行算法和平滑处理等步骤，用伪彩色编码得到血管直径图，该方法准确性高。

内质网生长机制Hooking

光性血栓的形成与恢复示意图

通过诱导小鼠光血栓形成，利用该方法研究脑血管血栓对邻近血管的影响，可获得血栓后血管直径信息，有助于研究血栓形成和变化。

结论与展望

光学成像手段辅以特定的光学材料、波探测元器件和深度学习等算法使得生物组织的成像深度不断拓展，进一步延展了人们对生命活动的观测能力。与此同时，对这些光学图像进行高精度、高灵敏的定量表征，能够揭示生物组织在生理病理过程中所发生的微小改变，进而提高人们对疾病的认知水平，并为多种重要疾病的诊疗提供新的视角和方法。

声明：本文仅用作学术目的。文章来源于：文志博, 刘开元, 蒋慎益, 何木斌, 韩涛, 斯科, 李鹏, 刘智毅, 钱骏, 丁志华. 生物组织大深度定量光学成像[J]. 光学学报, 2022, 42(17): 1717001. Zhibo Wen, Kaiyuan Liu, Shenyi Jiang, Mubin He, Tao Han, Ke Si, Peng Li, Zhiyi Liu, Jun Qian, Zhihua Ding. Large-Depth Quantitative Optical Imaging of Biological Tissues[J]. Acta Optica Sinica, 2022, 42(17): 1717001.