小富在售后时常常会收到老师同学反馈细胞养得好好的，生长状态不错、形态还非常好，但冻存过后再复苏后细胞就开始不贴壁了。这其中涉及的因素过多，这篇小富在这里先就整理一部分原因。

原因总结

01

冻存液质量过次

冻存细胞时使用于冻存的溶液质量过次。无论甘油还是DMSO ，质量都是非常重要，质量过次导致细胞在冻存过程中死亡。

02

冻存细胞长时间在常温下

放入冻存液的细胞长时间暴露在常温下。DMSO作为实验室常用于配置细胞冻存液的关键冻存试剂，在低温条件下可以起到保护细胞的作用，但在常温下对细胞有毒性。如果长时间暴露在常温下，就会导致细胞全部凋亡。这就是为什么讲究“速溶“的原因。

03

冻存时间把控出错

程序冻存细胞时间把控出现错误。实验室常配置的细胞冻存液都需要进行一段程序降温才能移入液氮保存，这一段程序时间较长，容易遗忘将正在进行冻存的细胞时间导致进入液氮前的程序冻存时间过长或过短，让冻存过程中的细胞状态受损。

04

配置比例出错

配置的冻存试剂的比例错误。DMSO是目前最常用的细胞冻存保护剂，一般使用时终浓度控制在5~10%，最佳浓度取决于细胞类型。一般来说，存活率比较高的细胞系，培养基、血清、DMSO按照7：2：1的比例新鲜配制使用。比例过多或少都会导致细胞状态受损。

05

细胞状态过差

冻存前细胞是否受过污染或状态不好。冻存操作本身就是对细胞有损伤的，如果冻存前细胞状态不行，经过冻存复苏后状态只会更差，出现大量的死细胞。冻存细胞前要确保细胞状态较好并有一定的细胞量才可以进行冻存操作。

06

冻存液未混匀

配置的冻存液未混匀。配置的冻存液未混匀也会导致细胞状态变差，有影响但不会太大。

07

冻存时间把控出现错

程序冻存细胞时间把控出现错误。实验室常配置的细胞冻存液都需要进行一段程序降温才能移入液氮保存，这一段程序时间较长，容易遗忘将正在进行冻存的细胞时间导致进入液氮前的程序冻存时间过长或过短，让冻存过程中的细胞状态受损。

08

细胞消化时间过长

细胞消化时间过长。对，又是细胞消化步骤，它不仅是贴壁细胞传代的必要步骤，而且也是贴壁细胞冻存的必要步骤。于传达不同是传代完成后培养就可以看到细胞是否在消化时出现问题，而冻存是需要复苏后培养才归为冻存失败的一点。

09

细胞密度过大

细胞密度过于密或未将细胞团吹开。由于细胞在冻存时只有大约1ml冻存溶液空间，且冻存也需要很长的时间，很容易造成细胞堆积过多过久导致细胞死亡。

以上是贴壁细胞冻存复苏后细胞不贴壁的部分原因，更多原因可在留言交流讨论。