荧光分光光度计工作原理：
由光源氙弧灯发出的光通过切光器使其变成断续之光以及激发光单色器变成单色光后，此光即为荧光物质的激发光，被测的荧光物质在激发光照射下所发出的荧光，经过单色器变成单色荧光后照射于测样品用的光电倍增管上，由其所发生的光电流经过放大器放大输至记录仪，激发光单色器和荧光单色器的光栅均由电动机带动的凸轮所控制，当测绘荧光发射光谱时，将激发光单色器的光栅，固定在最适当的激发光波长处，而让荧光单色器凸轮转动，将各波长的荧光强度讯号输出至记录仪上，所记录的光谱即发射光谱（emission spectrum），简称荧光光谱。
当测绘荧光激发光谱时，将荧光单色器的光栅固定在最适当的荧光波长处，只让激发光单色口的凸轮转动，将各波长的激发光的强度讯号输出至记录仪，所记录的光谱即激发光谱（emission spectrum）。
当进行样品溶液的定量分析时，将激发光单色器固定在所选择的激发光波长处，将荧光单色器调节至所选择的荧光波长处，由记录仪得出的信号是样品溶液的荧光强度。