非洲猪瘟病毒荧光PCR检测试剂盒【FT-ZWSJ2】 Комплект за откриване на флуоресцентни PCR вируси на африканска чума по свинете 非洲猪瘟病毒荧光PCR检测试剂盒【FT-ZWSJ2】：ASFV可经过口和上呼吸道系统进入猪体，在鼻咽部或是扁桃体发生感染，病毒迅速蔓延到下颌淋巴结，通过淋巴和血液遍布全身。强毒感染时细胞变化很快，在呈现明显的刺激反应，细胞都已死亡。弱毒感染时，刺激反应很容易观察到，细胞核变大，普遍发生有丝分裂。发病率通常在40%—85%之间，死亡率因感染的毒株不同而有所差异。高致病性毒株死亡率可高达90—100%;中等致病性毒株在成年动物的死亡率在20%—40%之间，在幼年动物的死亡率在70%—80%之间;低致病性毒株死亡率在10%—30%之间。

　　非洲猪瘟病毒荧光PCR核酸检测试剂盒说明书

【兽药名称】

　　通用名称：非洲猪瘟病毒荧光PCR核酸检测试剂盒

　　汉语拼音:Feizliouzhuwen Bingdu Yingguang PCR Hesuan Jianceshijihe

　　英文名称：African swine Fever Virus (ASFV) PCR Nucleic Acid Diagnostic Kit

　　商品名称：无

【主要成分与含量】试剂盒中含有如下组分:

【用法与判定】

　　1 用法

　　1.1待检样品釆集、保存及运输

　　1.1.1样品釆集

(1) 活猪样品 无菌采集抗凝血或血清5mL

(2) 病死猪剖检样品或屠宰场剖检样品 无菌采集死猪的牌、肺、肾、扁桃体、淋巴结、肌肉等组织样品。2〜8°C低温运至实验室用于检测。

(3) 病猪污染的周边环境 采集与病猪相关场所的粪便、饲料、污水样品。2〜8°C低温运至实验室用于检测。

　　1.1.2样品保存 采集的样品在2〜8°C保存应不超过24小时，-70°C条件下保存，避免反复冻 融。

　　1.1.3样品运输泡沫箱加冰袋后密封进行运输。包装和运输应符合农业农村部《高致病性动 物病原微生物菌(毒)种或者样品运输包装规范》和交通运输部门关于危险品运输管理的有关规定。

　　1.2样品处理

　　1.2.1血液样品处理 抗凝血样品置于离心管中，8000 r/min离心2分钟取上层血浆，编号待 检。非抗凝血样品置于离心管中，待凝固后，8000 r/min离心2分钟取200μL上层血清，编号待检。

　　1.2.2组织样品处理取适量脾脏、肝脏、淋巴结、扁桃体、肌肉等组织，置于研磨器或研磨管中研磨，再加适量生理盐水混匀，制成约10%的组织匀浆，8000 r/min离心2分钟，取200μL上 清于RNase/DNase-free无菌离心管中，编号备用。

　　1.2.3环境样品处理

　　1.2.3.1粪便、饲料样品处理方法取适量的粪便、饲料放入盛有PBS缓冲液的研磨管中研磨混匀，制成约10%的匀浆液.8000 r/min离心2分钟，取200μL上清于RNase/DNase-free无菌离心 管中，编号备用。

　　1.2.3.2污水样品处理方法 直接取200μL污水进行核酸提取。

　　1.3病毒核酸的提取用磁珠法或柱式法进行DNA核酸提取。

　　1.4荧光PCR反应：

　　1.4.1从试剂盒中取出荧光PCR反应液、酶混合液，室温融化后，2000 r/min离心5。设被 检样品、阳性对照和阴性对照总和为n,则反应体系配制如下：

　　试剂 体系

　　PCR 反应液 17× (n+1) μL

　　酶混合液 3× (n+1) μL

　　1.4.2在新的RNase/DNase-fire 1.5 ml离心管中加入上述试剂，充分混匀后瞬时离心。按照20μL/ 管分装量将试剂分装至荧光PCR反应管。

　　1.4.3在上述制备好的荧光PCR反应管中分别加入阴性对照、阳性对照各5μL、处理好的待测核酸各5μL,终体积25μL/管，盖好荧光PCR反应管盖，混匀后瞬时离心，转移到荧光PCR仪器 上。

　　144将PCR反应管放置在荧光PCR仪样品槽中，在荧光PCR仪上运行以下程序：

　　荧光通道选择FAM,在PCR扩增阶段每个循环的55℃时采集荧光信号。设置扩增体系为25μL, 同时要选择passive reference和quencher为的模式。(注：若荧光PCR仪(如AB17500)按说明 书中的反应程序设置后因持温时间短无法运行，可将预扩增和PCR扩增条件变更为95C： 5 55°C： 30 )