测定蛋白核酸含量的应用方案(超微量紫外可见分光光度计)

实验原理

测蛋白质含量的原理

由于蛋白质分子中酪氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，因此蛋白质有吸收紫外线的性质，吸收高峰在280nm波长处。在此波长范围内，蛋白质溶液的光吸收值( A280)与其含量成正比关系，可用作定量测定。

测核酸含量的原理

核酸及其衍生物，核苷酸、核苷、嘌呤和嘧啶有吸收UV的性质，其吸收高峰在260nm波长处。DNA浓度( ug/ml) =A260/0.024/L*稀释倍数(L为比色池厚度1cm)

仪器及试剂

美析UL-1000超微量紫外可见分光光度计

标准蛋白溶液。结晶牛血清蛋白，预先经微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，根据其纯度配制成1mg/ml蛋白溶液。

待测蛋白溶液

核酸溶液

操作步骤

绘制标准曲线

按下表分别向每支试管加入各种试剂，摇匀。选用光程为1cm的石英比色杯，在280nm波长处分别测定各管溶液的0A280值。以A280值为纵坐标，蛋白质浓度为横坐标，绘制标准曲线。

样品测定

取待测蛋白质溶液1ml,加入蒸馏水3ml，摇匀，按上述方法在280nm波长处测定光吸收值，并从标准曲线上查出待测蛋白质的浓度。

取待测核酸溶液1ml， 加入蒸馏水3ml，测定核酸的浓度。

实验结果

测得的八个试管中溶液的A值如图所示

蛋白质样品的A值为0.063

核酸样品的A值为0.039

蛋白质含量

根据方程当A=0. 063时，0. 0630=0. 6123c+0. 0070.

C=0.0945mg/ml .

因为溶液稀释了4倍，所以样品蛋白的浓度为

0.0945*4=0. 378mg/ml

核酸含量

DNA浓度= A260/0.024/L*稀释倍数

=0.039/0.024/1*4

=7.8 ug/ml