本试剂盒仅供科研使用
土壤亚硝酸还原酶（Solid-Nitrite reductase，S-NiR）试剂盒说明书
(货号：WS0130W 微板法 48 样)
一、产品简介：
土壤亚硝酸还原酶是反硝化作用的关键酶，它是由土壤反硝化细菌产生的一种还原类
酶，参与亚硝酸盐至 NO 的还原反应，它的活性反映了生物降解过程中氮素的转化效率，
为氮素转化规律的研究提供一定的依据。
土壤亚硝酸还原酶可将 NO2-还原为 NO，使样品中参与重氮化反应生成（粉）红色化
合物的 NO2-减少，该（粉）红色物质在 540nm 有da吸收峰，通过检测 540nm 处吸光
值的变化来反应土壤亚硝酸还原酶的活性。
二、试剂盒组分与配制：
试剂名称
规格试剂名称
保存要求
备注
试剂一
液体 30mL×1 瓶
4℃保存
试剂二
液体 55mL×1 瓶
4℃保存
有沉淀，临用混匀即可
试剂三
液体 22mL×1 瓶
4℃保存
试剂会出现过饱和，临用 25℃水浴，
5min 即可使用
试剂四
A 液 12mL×1 瓶
4℃保存
临用，可依据待检测样本数量，把 A
液和 B 液等比例混合成无色的反应 mix
（注意观察，若变粉色，则不能使用）。
两天之内用完。
B 液 12mL×1 瓶
标准品
粉体 mg×1 支
4℃保存
若重新做标曲，则用到该试剂
三、所需的仪器和用品：
酶标仪、96 孔板、天平、水浴锅、低温离心机、可调式移液器。
四、土壤亚硝酸还原酶（S-NiR）的测定：
建议正式实验选取 2 个样本做预测定，了解本批样品情况，熟悉实验流程，避免实验
样本和试剂浪费！
1、样本制备
取新鲜土样风干或者 37 度烘箱风干，先粗研磨，过 40 目筛网，备用。
【注】：土壤风干，减少土壤中水分对于实验的干扰；土壤过筛，bao证取样的均匀细腻；
2、测定步骤
① 酶标仪预热 30min 以上，调节波长至 540nm。
② 在 EP 管中依次加入：
试剂名称（
μL）
测定管
无基质对照管
无土对照管
（仅做一次）
土样（
g）
0.1
0.1
试剂一
400
400
蒸馏水
800
1200
800
试剂二
500
500
500
混匀，且务必用封口膜封口，25℃，培养 24h
试剂三
200
200
200本试剂盒仅供科研使用
2
混匀，12000rpm，4℃离心 10min，上清液待用。
③ 显色反应，②步得到的上清液用蒸馏水稀释 50 倍后，在 96 孔板中依次加：
上清液
20
20
20
反应 mix
200
200
200
混匀，25℃反应 5min（准确时间），立即于 540nm 处读取 A 值，△A=A
无土对照管-（A 测定管-A 无基质对照管），（每个样本需做一个自身
对照）。
【注】：若△A 值低于 0.01，可增加土壤样本取样质量 W（如由 0.1g 增至 0.25g），则改变
后的 W 需带入公式重新计算。
五、结果计算：
1、标准曲线方程：y = 2.2688x - 0.0011；x 为标准品浓度（
μmoL/mL），y 为吸光值△A。
2、单位定义：每克土壤每天还原 1μmoL 的 NO2 ˉ量为一个酶活力单位。
S-NiR(μmoL/d/g 土壤)=[(△A+0.0011)÷2.2688×V1]÷W÷T×D
=0.84×(△A+0.0011)÷W×50
3、单位定义：每克土壤每天还原 1μg 的 NO2 ˉ量为一个酶活力单位。
S- NiR(μg/d/g 土壤)=[(△A+0.0011)÷2.2688×V1]÷W÷T×46×D
=38.64×(△A+0.0011)÷W×50
V1－－-反应体系总体积，1900μL=1.9mL；
T－－-反应时间，24h=1d；
W－－-土样实际质量，g；
D－－-稀释倍数，50 倍；
标准品的分子量－－-69；
NO2 -的分子量－－-46。
附：标准曲线制作过程：
1 制备标准品母液（100μmol/mL）：把标准品wan全溶解于 1mL 蒸馏水中（母液需在两
天内用且-20℃保存）。
2 把母液用蒸馏水稀释成六个浓度梯度的标准品：0, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5. μmol/mL。也
可根据实际样本来调整标准品浓度。
3 依据显色反应阶段的测定管的加样顺序操作，根据结果即可制作标准曲线。
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