1.仪器和材料
1. 聚苯乙烯微量细胞培养板(平板, 40, 96孔)。
2. 酶联免疫检测仪
3. 辣根过氧化物酶羊抗兔IgG, 工作稀释度1:1000。
4. 包被液::0.05mol/L pH9.6碳酸缓冲液,4℃,保存, Na2CO3 0.15克, NaHCO3 0.293克,蒸馏水稀释至100 ml。
5. 稀释液:0.01mol/LpH7.4 PBS--Tween--20, 4℃,保存. NaCl 8g, KH2PO4 0.2g, Na2HPO4.12H2O 2.9g, Tween-20,0.5ml. 蒸馏水加至1000ml。
6. 洗涤液:同稀释液
7. 封闭液:0.5%鸡卵清蛋白,pH7.4 PBS。
8. 邻苯二胺溶液(底物):临用配制 0.1M 柠檬酸(2.1g/100ml), 6.1ml 0.2M Na2HPO4.12H2O (7.163g/100ml) 6.4ml, 蒸馏水12.5ml, 邻苯二胺10mg, 溶解后, 临用加30%H2O2 40 微升。
9. 终止液:2mol/LH2SO4。
ELISA方法的基本原理是:
①使抗原或抗体结合到某种固相载体表面,并保持其免疫活性。
②使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体,这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性,又保留酶的活性。在测定时,把受检标本(测定其中的抗体或抗原)和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开,蕞后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成定的比例。加入酶反应的底物后,底物被酶催化变为有色产物,产物的量与标本中受检物质的量直接相关,故可根据颜色反应的深浅刊物定性或定量分析。由于酶的催化频率很高,故可放大反应效果,从而使测定方法达到很高的敏感度。因此,ELISA检测是项定位、定性和定量(敏感度可达每毫升ng~pg的水平)的综合技术。常用的酶是辣根过氧化物酶(HRP)和碱性磷酸酶(AKP)

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