引言：干血斑分析法（DBS）在医药行业正变得愈发重要。动物实验所带来的经济及伦理道德方面的问题，以及在运输以及储存生物样品时所产生的高额费用问题，都使得DBS分析法成为种颇具吸引力的选择。DBS 分析法可取得较高的分析物回收率。然而，该技术在去除内源性干扰方面收效甚微。以残余磷脂（PLs）为主的干扰物是生物分析中遇到的主要问题。而LC/MS/MS系统中PLs的蓄积，则是引发基质效应的主要原因。在所有其他问题之中，基质效应会以无可预测的方式影响质谱响应值，降低分析方法稳定性并增加其可变性。Ostro 96孔样品制备板则可消除99%以上的PLs残留。Ostro 96孔板可通过使用96孔制备板的形式进步简化DBS萃取流程，同时提取分析物、去除磷脂、过滤干血斑纸片。DBS样品可在孔内萃取并稀释直接进样到LC/MS/MS液质联用系统中。该创新方法能够显著降低样品制备时间，并在萃取转化、干燥、复溶过程中避免潜在的分析物流失。在本应用纪要中，我们同时应用了传统方法和Ostro 96孔样品制备板方法，对含有利培酮、利培酮羟基化代谢物、 9-OH利培酮及其内标氯氮平（图1）的全血样品进行了萃取。

实验部分： ACQUITY UPLC条件色谱柱： ACQUITY UPLC BEH C18， 2.1×50 mm，1.7 μm 流动相A： 0.1% NH4OH 水溶液流动相B： 50/50 ACN/MeOH 流速： 0.6 mL/min 梯度： 时间 梯度模式 梯度线型 (min) %A %B 0.0 75 25 6 2.0 0.5 99.5 6 3.0 0.5 99.5 6 3.1 75 25 6 3.5 75 25 6 进样量： 40 μL 进样模式： 部分环进样柱温： 35 ℃ 样品温度： 15 ℃ 强洗针液： 60:40 ACN:IPA＋2% HCOOH 弱洗针液： 95/5 H2O/MeOH 沃特世Xevo TQ-S MS运行条件，ESI + 毛细管电压： 3.0 V 脱溶剂温度： 550 ℃ 锥孔气流速： 150 L/Hr 脱溶剂气流速： 1000 L/Hr 碰撞池压力： 2.6×10(-3) mbar MRM通道监测，ESI+参见表1

样品制备条件将20 μL的全血样品滴在未经处理的Whatman DMPK-C血卡上。样品随后在室温下干燥2小时。使用Harris 3 mm微打孔器取3 mm 血斑，分别放置进传统型DBS 萃取法所需的1.5 mL离心管和 Ostro 96孔板孔中。传统萃取方法在1.5 mL离心管中进行，使用了250 μL含5%水的甲醇溶液，随后样品进行1分钟涡旋、1分钟3000 g离心，并终将萃取物转移至96孔板上。使用Ostro 96孔板的萃取则采用单步孔内萃取法。在Ostro 96孔板中添加 3 mm干血斑（图2）。以250 μL 含5%水的甲醇溶液作为萃取溶液，涡旋操作1分钟、空操作5分钟。两种方法产生的洗脱液都用 250 μL 的水进行稀释，然后进样到LC/MS/MS系统中。

结果与讨论：在正离子模式下进行MS分析。鉴于DBS萃取物的直接进样通常会导致稀释的样品，我们采用 Xevo TQ-S以显著提升系统的灵敏度。这同时也有助于直接进样，并避免了吹干、复溶过程中可能存在的问题。针对每种样品制备方法，我们都比较了磷脂残留量。为了达成这目的，我们对单个试管萃取和使用Ostro PLR板孔内萃取的DBS进行了比对，对五种磷脂进行了量化。与传统型DBS分析法相比，Ostro板去除磷脂比例高达99.9%（图3）。为能直观展示残余磷脂，传统型DBS萃取法和使用 Ostro的孔内DBS萃取法所产生的五种不同磷脂的总离子流（TIC）如图所示（图4）。当使用Ostro板时，磷脂残留量几乎可忽略不计，且无蓄积情况。而当使用传统型DBS法时，即便出于预防磷脂蓄积的目的，采用高比例有机溶剂进行了1分钟的清洗，磷脂残余量依旧显著，而且在整个过程中都有蓄积。我们进行了半验证，计算QC样品浓度不足预期值的15%，满足法规标准。9-OH利培酮（图6）及其母化合物LLOQ在全血中都达到 0.05 ng/mL。标准曲线在3个以上数量呈线性，全血中的线性范围从0.05 ng/mL到50 ng/mL（图7）。

结论 ■ 简便、单步的DBS样品制备方法 ■ 相较于传统的DBS萃取技术，去除残余磷脂含量高达99.9% ■ 采用Xevo TQ-S三重四杆液质联用质谱仪，获得高灵敏度 ■ 去除LC色谱柱中PLs的蓄积