中华人民共和国国家标准

水质急性毒性的测定发光细菌法

1.1主题内容

本标准规定了测定水环境急性毒性的发光细菌法。

1.2适用范围

本标准适用于工业废水、纳污水体及实验室条件下可溶性化学物质的水质急性毒性监测。

2方法提要

基于发光细菌相对发光度与水祥毒性组分总浓度呈显著负相关（PW0. 05）,因苗可通过生物发光 光度计测定水样的相对发光度,以此表示其急性毒性水平。

水质急性毒性水平按8所述条件选用相当的参比毒物氯化汞浓度（以mg/L为单位）来表征，或选 用EC＇。值（半数有效浓度一-以样品液百分浓度为单位）来表征。

3试剂和材料

本标准所用试剂除另有说明外,均应为符合国家标准的分析纯试剂、蒸值水或同等纯度的水。

3.1氯化汞HgCl2.

3.2氧化钠NaCl,化学纯。

3.3明亮发光杆菌T3小种（Photobacterium phosphoreum T3 spp.）冻干粉，安甑瓶包装，每瓶0. 5g,在 2〜5C冰箱内有效保存期为6个月.新制备的发光细菌休眠细胞（冻干粉）密度不低于每克800万个细 胞;当按6. 2. 4步骤将冻干粉复苏2 min后即发光（可在暗室内检验，肉眼应见微光），稀释成工作液后 每毫升菌液不低于1- 6万个细胞（5 ml测试管）或2万个细胞（2 ml测试管）（均为稀释平板法测定）。在 毒性测试仪上测出的初始发光量应在600-1 900 mV之间，低于600 mV允许将倍率调至“X2”档，高 于1900 mV允许将倍率调至“X0. 5”档。仍达不到标准者,更换冻干粉。

3.4氯化钠溶液,3g/100 mL

氧化钠3 g于玻璃容器内，用量筒加蒸慵水100 ml。

3.5氧化钠溶液,2g/100mL

氧化钠2 g,加蒸储水100 ml,于试剂瓶内，2〜5C保存。

3.6参比毒物氯化汞标准溶液。

0. 02,0. 04,0. 06,0. 08,0.10,0.12,0.14,0. 16,0.18,0. 20,0. 22,0, 24 mg/L。

3.7 氧化汞母液,p=2 000 mg/L。

万分之一分析天平精称密封保存良好的无结晶水氯化汞0. 100 0 g入50 ml容量瓶，用3g/100 ml 氯化钠溶液稀释至刻度，置2〜5C冰箱备用，保存期6个月。

国家环境保护局1995-03-25批准"~1995-08-01实施

GB/T 15441-1995

3- 8氧化汞工作液,*=2 mg/L。

用移液管吸氯化汞2 000 mg/L母液10 ml入1 000 ml容量瓶，用3 g/100 ml氧化钠溶液定容。再 用移液管吸取氯化汞20 mg/L液25 ml入250 ml容量瓶，用3 g/100 ml氧化钠溶液定容，将此液倒入 ,配有半微量滴定管的试液瓶，然后，用3 g/100 ml氯化钠溶液将疑化汞2 mg/L溶液按表1稀释成系列 浓度（一律采用50 ml容量瓶）。这些氧化汞稀释液保存期不超过24 h,超过者务必重配。

表1氯化汞工作溶液稀释配制系列（在50 ml容量瓶中）

加氯化汞（2 mg/L）数,ml0.51.01.52.02.53.03.54.04.55.05.56.0

稀释定容后氯化汞浓度,mg/L0.02 0.04 0.06 0.08 0. 10 0.12 0.14 0.16 0.18 0.20 0.22 0.24

4仪8S

4.1生物发光光度计。

配置2或5 ml测试管。

当果;化汞标准溶液浓度为0.10 mg/L时，发光细菌的相对发光度为50%，其误差不超过士 10% o

4.2 2 ml或5 ml测试样品管（具标准磨口塞,为制造比色管的玻璃料制作，由专业玻璃仪器厂制造）， 分别适用于相应型号的生物发光光度计。

4.3微量注射器；10

4.4注射器：lml0

4.5定量加液瓶：5ml。

4.6 吸管：2、10、25mL

4 7试剂瓶:100 ml。

4.8 量筒：100、500 ml。

4.9 棕色容量瓶：50、250、1 000 ml。

4.10半微量滴定管（配磨口试液瓶,全套仪器均为棕色）:10 ml。

5样品

5.1样品的采集和保存

a.采样瓶使用带有聚四氯乙烯衬垫的玻璃瓶，务必清洁、干燥。采集水样时，瓶内应充满水样不留 空气。采样后，用塑胶带将瓶口密封。

b.毒性测定应在采样后6 h内进行。否则应在2〜5C下保存样品，但不得超过24 h。报告中应写 明水样采集时间和测定时间。

c.对于含固体悬浮物的样品须高心或过滤去除，以免干扰测定。

5.2样品液的稀释

5.2.1样品液测定前稀释的条件

5.2.1.1样品液预试验 取事先加瓠化钠至3 g/100 ml浓度的样品母液2 ml装入样品管，并设一支 CK管（氧化钠3 g/100 ml溶液），按6所述测定相对发光度。

5.2.1.2按5.2.1.1测得的样品，相对发光度低于50%乃至零，欲以EC”表达结果，则须稀释。

5.2.13按5. 2.1.1测得的样品,相对发光度在1%以上,欲以与相对发光度相当的疑化汞浓度表达 结果,则不须稀释。

5.2.2样品液的稀释液

样品液的稀释液一律用蒸懈水，在定容前一律按构成氧化钠3 g/100 ml浓度添加氯化钠或浓溶液 （母液只能加固体）。

5.2.3样品液稀释浓度的选择

GB/T 1 5441-1 995

5. 2.3.1探测试驶

按对数系列将样品液稀释成5个浓度：100%、10%、1%、。.1%、0.01%（它们的对数依次为。,一1， 一2, — 3, — 4）,按6所述粗测-遍视1%〜100%相对发光度落在哪一浓度范围。

5・2.3.2试验

在1%〜100%相对发光度所落在的浓度范围内再增配6〜9个浓度（例如，若落在0. 1%〜10%之 间，则应稀释成。.l%、0. 25%、0.5%、0. 75%、1%、2.5%、5%、7.5%、10%;若落在 1%〜10%之间，则 应稀释成1%、2%、4%、6%、8%、10%）,按6所述再测一遍;这6〜9个浓度，也可通过查对数表，按等 对数间距原则自行确定（例如，若落在1%〜10%之间，则应稀释成10%、6. 31%、3. 98%、2. 51%, 1. 58%、1. 00%,它们的对数相应为 1. 00.0. 80,0. 60,0. 40.0. 20.0. 00,对数间距均为 0. 2）。

6测定

6-1测定条件

6.1.1室温

室温20〜25C。

同一批样品在测定过程中要求温度波动不超过±「C °且所有测试器皿及试剂、溶液测前1 h均置 于控温的测试室内。

6-1-2 pH

若须测定包括pH影响在内的急性毒性，不应调节水样pH。

若须测定排除pH影响在内的急性毒性，须将水样和CK（氯化钠3 g/100 ml）pH测前调至下值:主 要含Cu水样为4. 5,主要含其他金属水样为5. 4,主要含有机化合物水样为7. 0。

6.1.3溶解氧

本法只能测定包括溶解氧影响在内的急性毒性。

6-2测定步骤

6.2.1试管的排列

于塑料或铁制试管架上按以下二种情况排列测试管。

6.2.1.1按5. 2.1.3所述，样品母液相对发光度为1%以上者，如下排列：

左侧放参比毒物氯化汞系列浓度溶液管，右侧放样品管。前排放氯化汞溶液和样品管，后一排放对 照（CK）管，后二排放CK预试验管。每管氯化汞或样品液均配一管CK（氧化钠3 g/100 ml蒸馋水溶 液）。设3次重复。每测一批样品，均须同时配置测定系列浓度氯化汞标准溶液。

表2试管在试管架上的排列

后二排CK* CKg2

后一排CK CK CK CK CK CK …CKCK CK CK CK CK CK …CK

前排0.02 0.02 0.02 0.04 0.04 0.04 … 0.24样】棒1样1祥2样2祥2…样”

管群氯化汞（mg/L〉样品

6. 2-1.2按5. 2.1. 2所述，样品母液相对发光度为50%以下乃至零者，如下排列：

左侧仅放氧化汞0. 10 mg/L溶液管（作为检验发光细菌活性是否正常的参考毒物浓度，它反应 15 min的相对发光度应在50%左右），右侧放样品稀释液管（从低浓度到高浓度依次排列）。其他同 6. 2. L 1。每测一批样品，均须同时配测氯化汞0. 10 mg/L溶液。

6.2-2加3 g/100 ml M化钠溶液

用5 ml的定量加液瓶给每支CK管加2或5 ml兼化钠3 g/100 ml（据仪器型号而定）。

6.2.3 加样品液

GB/T 15441-1995

用2或5 ml吸管给每支样品管加2或5 ml样品液（据6.2.2而定）。每个样品号换■支吸管。 6.2.4发光细菌冻干菌剂复苏

从冰箱2〜5 C室取出含有0.5 g发光细菌冻干粉的安甑瓶和氯化钠溶液，投入置有冰块的小号 （1〜1. 5 L）保温瓶，用1 ml注射器吸取0. 5 ml冷的氯化钠2 g/100 ml（适用于5 ml测试管）或1 ml冷 的氯化钠2. 5%（适用于2 ml测试管）注入已开口的冻干粉安甑瓶，务必充分混匀。2min后菌即复苏圜 光（可在暗室内检验，肉眼应见微光）。备用。

6.2.5仪器的预热和调零

打开生物发光光度计电源，预热15 min,调零,备用。

6.2-6仪器检验复苏发光细菌冻干粉质量

另取一空2或5 ml测试管，加2或5 ml氯化钠3 g/100 ml（据6. 2. 2而定），加10』复苏发光菌 液，盖上瓶塞，用手斯倒5次以达均匀。拔去瓶塞,将该管放入各自型号仪器测试舱内，若发光量立即显 示（或经过5〜10 min上升到）60qfmV以上，此瓶冻干粉可用于测试，低于者按3.1. 4处理。菌液发光量 先缓慢上升,约持续5〜15 min,后缓慢下降,约持续4 h。满4 h的CK发光量应不低于400 mV,低于者 更换冻干粉。

6.2.7给各测试管加复苏菌液

在发光菌液复苏稳定（约半小时）后，按6. 2所述，从左到右,按氯化汞或样品管（前）一CK管（后） 一氯化汞或样品管（前）一CK管（后）……顺序，用10贝微量注射器（勿用定量加液器以减少误差）准确 吸取10 R复苏菌液,逐一加入各管，盖上瓶塞，用手颠倒5次，拔去瓶塞,放回原位（每管加菌液间隔时 间勿短于30 s°每管在加菌液的当时务必精确计时,记录到秒，即为样品与发光菌反应起始时间°立即将 此时间加殖重,记作各管反应终止（也即应该读发光量）的时间。

6.2.8发光细菌与样品反应达到终止时间的读数

按各管原来加菌液的先后顺序，当某管达到记录的反应终止时间，在不加瓶塞的情况下，立即将测 试管放入仪器测试舱，读出其发光量（以光信号转化的电信号——电压mV数表示）。

6.2.9有色样品测定干扰的校正

a.拿掉仪器样品船上的黑色塑料管口 ；

b.取一 2 ml测试管（直径12 mm），加氯化钠3 g/100 ml溶液2 ml,将该管放进一装有少量氧化 钠3 g/100 ml溶液的5 ml管（直径20 mm）内，要使外管与内管的氯化钠3 g/100 ml液面平齐。此作CK 管，

c.另取一 2 ml测试管，加氯化钠3 g/100 ml溶液2 ml,放入另一装有少量有色待测样品液的 5 ml管内，要使外管与内管的氧化钠3 g/100 ml液面平齐。此作CKc管*

d.于CK和CKc二管的内管中同时加复苏发光菌液10 "1（注意:必须是本批样品测定所用同一 瓶篡苏菌液），立即记时到秒，等反应满15 min,迅即放入仪器测试舱，测定二只带有内管的5 ml测试管 的发光量。分别记下发光量京CK管）和乙2（CKc管）；

e.计算因颜色引起的发光量（mV）校正值

f.按6. 2.7和6. 2. 8所述常规步骤测试带色样品管及其CK管（氯化钠3 g/100 ml溶液）的发光 量（mV）。所有CK管测得之发光#（mV）均须减去校正值乂（mV）后才能作为CK发光量（mV）。

GB/T 15441-1995

图1有色样品溶液测定干扰的校正

7测试结果的春达

7-1计算样品相对发光度（％），并算出平均值。

相对发光度（%）=氧化噬碧龄寂时）x 100（ 1）

相对发光度（％）平均值=（重复以^%）+（重复;）（％）+（重复3）（%）……（2）

7. 2符合5. 2.1.3条件者，建立并检验氯化汞浓度（C）与其相对发光度（『）％均值的相关方程,也可以 绘制关系曲线。

».求出一元一次线性回归方程的a（截距）0（斜率、回归系数）和「（相关系数），列出方程」

T ~ a-\- V■化秉（ 3 ）

查相关系数显著水平（P值）表，检验所求，值的显著水平。若-W0. 01,且EG。皿秉=0. 10 ±0. 02mg/L,则所求相关方程成立;反之，不能成立，须重测系列甄化汞浓度的发光景.氯化汞溶液配 制过夜者，须重配后再测定。

b.也可以据建立的上述方程绘制关系曲线。即指定发光度为10%和90%，代入上式，求出相应的 二个林化汞浓度，在常数坐标纸上，定出二点，画一直线,即为符合该方程的巍化汞浓度与相对发光度的 关系曲线。

7. 3符合5. 2.1. 2条件者，建立并检验样品稀释浓度（C）与其相对发光度（T）%均值的相关方程，绘制 关系曲线。

按7. 2所述方法建立相关方程T=a+6C样，并检验相关系数r显著水平（P值）。若P<0. 05,则所 求相关方程成立;反之，不能成立，须重测样品稀释系列浓度的发光量。

8根据测试结果表达样品急性毒性

8.1用氧化汞浓度表达样品毒性

8.1.1适用的条件

符合5.2.1. 3条件（样品母液相对发光度大于1 %）并按7. 2建立了合格（PWO. Ol、EC5on化彖=0.10 士0. 02 mg/L）的氧化汞浓度与其相对发光度相关方程者。

8.1.2表达方法

GB/T 15441—1995

a.将测得的样品相对发光度，代入7. 2的相关方程，求出与样品急性毒性相当的氮化汞浓度（一 般用mg/L表示）；

b.测试结果报告同时列举样品相对发光度及其相当的氯化汞浓度值。 8.1.3适用性

适用于相对发光度在1%以上、特别是50%以上（即不可能出现EC、。值）但低于100%（即仍有中、 低水平毒性）的样品毒性测定。

8.2用ECs。值表达样品毒性

8.2.1适用的条件

符合5. 2.1. 2条件（样品母液相对发光度低于50%乃至零）并按7.1建立了合格（P<0. 05）的样品 稀释液浓与其相对发光度相关方程者.

8.2.2表达方法

a.将T=50代入7. 3建立的相关方程，求出样品的EG。值。这里的EC*值以样品的稀释浓度（一 般用百分浓度）表示；

b.测试结果报告列举样品的ECg值•

8.2.3适用性

适用于相对发光度在50%以下、特别是零（即毒性水平较高或很高）的样品毒性测定，后者无法以 相当的氧化汞浓度表达毒性。

8.3测定记录格式（见表3）

表3样品急性毒性发光细菌测定法实验记录

测定日期测定人提取方式

L=a+bC,a=6=

回归方程P<

GB/T 15441-1995

8.4测定结果报告内容

a.实验室室温；

b.采样地点、日期、时间；

c.氧化汞浓度或样品稀释百分浓度与相对发光度的相关方程：

T = a + bC

『=尸<ECS0«

d.样品EC5。值（稀释百分浓度）或相对发光度（%）及其相当的氯化汞浓度（mg/L）；

e.测定人及所在单位。

9方法的精密度

附加说明：

本标准由国家环境保护局科技标准司提出，本标准由中国科学院南京土壤研究所负责起草。本标准起草人顾宗濂、谢思琴、周德智、乔鸿泽。

本标准委托中国环境监测总站负责解释。

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