提供者：上海一基实业有限公司 发布时间：2019/7/15 8:55:06 阅读次数：4000次 进入该公司店铺
这里1分子CO2被固定，就有2分子 NADH 被氧化。因此，由NADH氧化的量就可计算Rubisco的活性，由340nm吸光度的变化可计算NADH氧化的量。
为了使NADH的氧化与CO2的固定同步，需要加入磷酸肌酸(CrP)和磷酸肌酸激酶(CPK)的ATP再生系统。
按照1 ml 反应体系计算，该试剂盒可以测定80-100个样品。
●自备材料：
植物材料；剪刀；液氮；研钵或其他研磨设备；1.5ml离心管；1ml石英比色皿；紫外分光光度计；制冰机；低温离心机
●操作步骤：
一、即用型Rubisco提取缓冲液配制：
一个反应配制体积 | n个反应配制体积 | |
1 ml | n×1 ml | |
Rubisco提取缓冲液（2×） | 0.5 ml | n×0.5 ml |
灭菌水 | 470 μl | n×470 μl |
1 M DTT（100×） | 10 μl | n×10 μl |
BSA溶液50mg/ml | 20 μl | n×20μl |
蛋白酶抑制剂（100×） | 10 μl | n×10μl |
注：1. 即用型Rubisco提取缓冲液尽量现配现用，短期4℃中可以过夜保存。
2. 为增强Rubisco的稳定性，提取缓冲液中可以加入蛋白酶抑制剂（Cat：PC2030）
二、Rubisco样品提取：
1. 取新鲜植物组织，清洗干净，擦干，液氮中研磨，1 cm2叶片（1分硬币大小）或0.1g粉末加入1 ml 即用型Rubisco提取缓冲液，颠倒混匀，冰浴放置5-10分钟。
2.12000g4℃离心 10分钟，上清即为Rubisco样品提取液，常温放置备用（不要冰浴或4℃放置，常温放置可以保持Rubisco活性）。
注：Rubisco样品提取液最好立即测定，不建议保存。
三、 Rubisco活性测定分析：
1. 即用型酶溶解缓冲液配制：
按照标签所示，在试剂10-酶溶解缓冲液原瓶中加入1.5 ml灭菌水和1 ml BSA溶液（50mg/ml），混匀后即配成即用型酶溶解缓冲液，冰浴备用，-20℃保存。
2. 试剂3-GAPDH和试剂5-CPK按照标签所示加入即用型酶溶解缓冲液，混匀溶解后冰浴备用，-20℃保存。
3. 试剂4-PGK为硫酸铵悬浮液，4℃12000g离心5分钟，去除上清（小心去除，可以保留少许上清，不要吸弃沉淀），沉淀中按照标签所示加入即用型酶溶解缓冲液，混匀溶解后冰浴备用，-20℃保存。
4. 试剂9-RuBP：按照标签所示加入灭菌水，彻底混匀后冰浴备用。
注：RuBP溶液稳定性较差，用后-20℃保存，有效期3-4天，长期-80℃保存。
5. 试剂8-NADH：按照标签所示加入灭菌水，彻底混匀后冰浴备用。
注：NADH稳定性较差，用后-20℃贮存3-4天，长期-80℃保存。
6. 反应体系MasterMix配制：
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