真菌/酵母细胞β1，3- D-葡聚糖合成酶活性定量检测试剂盒产品说明书（中文版）
主要用途
真菌/酵母细胞β1，3- D-葡聚糖合成酶活性定量检测试剂是一种旨在通过β1，3- D-葡聚糖合成酶
反应系统中尿嘧啶核苷-5’-二磷酸葡萄糖底物聚合成葡聚糖，与荧光染料结合产生荧光峰值的变化，来测定
样品中酶活性的权威而经典的技术方法。该技术由大师级科学家精心研制、成功实验证明的。其适用于各
种真菌或酵母细胞株裂解悬液中β1，3- D-葡聚糖合成酶的活性检测。产品严格无菌，即到即用，操作简捷，
性能稳定，具有高通量特点。
技术背景
真菌/酵母细胞壁结构具有丰富的糖蛋白外层和碳水化合物内层，包括（1,3）-β-D，（1,6）-β-D和（1,3）-α-D-
葡聚糖（glucan）。其中（1,3）-β-D为主要元素。1,3-β-D-葡聚糖合成酶（1,3-β-D-glucan synthase；GS；
EC.2.4.1.34），又称为尿嘧啶核苷-5’-二磷酸葡萄糖：1,3-β-葡萄糖基转移酶（UDP-glucose：1,3-β-glucosyl
transferase），催化以尿嘧啶核苷-5’-二磷酸葡萄糖（UDP-glucose）为底物，通过1,3-β链接聚合为葡聚糖的
反应，构成真菌/酵母细胞壁结构中主要碳水化合物成分1,3-β-D-葡聚糖，为细胞生长所必需。1,3-β-D-葡聚
糖合成酶具有两种结构体：1个调节亚体，GTPase Rho1p和4个催化亚体，Bgs1p－4p或Fksp。（1,3）-β-D-
葡聚糖合成酶成为抗真菌药物，例如卡泊芬净（caspofungi）等的靶标。基于底物UDP-glucose在葡聚糖合
成酶的催化下，聚合成（1,3）-β-D－葡聚糖产物，与苯胺蓝（Aniline blue；4,4-（carbonyl-bis（benzene-4,1-
diyl）-bis-（imino）-bis-benzenesulfonic acid）反应产生复合物，呈现荧光峰值的变化（激发波长400nm，散
发波长460nm），由此定量测定β1，3- D-葡聚糖合成酶的活性。
产品内容
裂解液（Reagent A） 毫升
强化液（Reagent B） 毫升
缓冲液（Reagent C） 毫升
底物液（Reagent D） 微升
终止液（Reagent E） 微升
反应液（Reagent F） 毫升
稀释液（Reagent G） 微升
标准液（Reagent H） 微升
产品说明书 1份
保存方式
保存在－20℃冰箱里；反应液（Reagent F）避免光照； 终止液（Reagent E）具有腐蚀
性，注意操作安全；有效保证6 月
1
用户自备
15 毫升锥形离心管：用于真菌/酵母细胞收集的容器
1.5 毫升离心管：用于真菌/酵母细胞裂解操作或反应液配制的容器
微型台式离心机：用于真菌/酵母细胞裂解悬液澄清
超速离心机：用于微粒体样品制备
恒温培养箱或恒温水槽：用于反应孵育
比色皿或酶标板：用于染色后荧光检测的容器
荧光分光光度仪或荧光酶标仪：用于荧光分析
实验步骤
一、 样品准备
1． 准备好10 毫升待测的新鲜真菌/酵母细胞（OD600＝0.4 至0.8，即1 至2 X 107细胞/毫升）
2． 移入到预冷的15 毫升锥形离心管
3． 置于冰槽里5 分钟
4． 放进4℃台式离心机离心10 分钟，速度为3000g
5． 小心抽去上清液
6． 加入xx 微升裂解液（ Reagent A），充分混匀
7． 转移到预冷的1.5 毫升离心管
8． 加入xx 微升强化液（Reagent B）（注意：参见注意事项3）
9． 强力涡旋震荡15 秒
10．置于冰槽里1 分钟
11．重复实验步骤9 至10 五次
12．加入xx 微升裂解液（Reagent A），充分混匀
13．放进4℃微型台式离心机离心10 分钟，速度为1000g（或3500RPM，例如eppendorf 5415）
14．小心移取500 微升上清液到新的预冷的1.5 毫升离心管
15．（选择步骤）如果使用微粒体样品，放进4℃超速离心机离心60 分钟，速度为100000g
16．（选择步骤）小心移取500 微升上清液到新的预冷的1.5 毫升离心管
17．移取 5 微升进行蛋白定量测定（注意：建议使用 Bradford 蛋白质浓度定量试剂盒－
30030.1 ）
18．即刻放进－70℃保存或置于冰槽里继续后续操作
二、 测定准备
1． 准备好待测样品（例如细胞裂解萃取液或微粒体样品等），置于冰槽里
2． 设定好荧光分光光度仪或荧光酶标仪（温度为25℃）：激发波长400nm，散发波长460nm，并置零
3． 准备好5 个1.5 毫升离心管，标记为1 至5 号管
4． 分别加入xx 微升稀释液（Reagent G）到2 至5 号管
5． 移取xx 微升标准液（Reagent H）到1 号管，混匀
6． 小心移取xx 微升1 号管稀释的标准液（Reagent H）到2 号管，混匀
7． 小心移取xx 微升2 号管稀释的标准液（Reagent H）到3 号管，混匀
2
8． 小心移取20 微升3 号管稀释的标准液（Reagent H）到4 号管，混匀
9． 将1 至5 号管置于室温下备用；标准管浓度见下表
管号 稀释液（Reagent G） 标准液（Reagent H） 标准葡聚糖浓度
1 ―― 微升 纳摩尔/升
2 微升 微升1 号管 纳摩尔/升
3 微升 微升2 号管 纳摩尔/升
4 微升 微升3 号管 纳摩尔/升
5 微升 0 0
三、 标准曲线测定
1． 移取xx 微升缓冲液（Reagent C）到1.5 毫升离心管
2． 加入5 微升上述配制的标准液
3． 加入xx 微升终止液（Reagent E）
4． 放进80℃恒温培养箱或恒温水槽孵育30 分钟，避免干枯
5． 加入xx 微升反应液（Reagent F），混匀
6． 放进50℃恒温培养箱或恒温水槽孵育30 分钟，避免光照
7． 室温下孵育30 分钟，避免光照
8． 转移到比色皿或酶标板
9． 即刻放进荧光分光光度仪检测：获得相对荧光读数
10．重复实验步骤1 至9 四次
11．构建标准曲线：纵座标（Y 轴）为相对荧光单位；横座标（X 轴）为标准葡聚糖浓度（纳摩尔/升）
四、 样品测定
1． 移取xx 微升缓冲液（Reagent C）到1.5 毫升离心管
2． 加入xx 微升底物液（Reagent D ）
3． 加入xx 微升上述制备的待测样品（20 微克微粒体蛋白或100 微克细胞裂解萃取液蛋白），混匀（注意：
样品须清澈）
4． 室温下（25℃）孵育30 分钟
5． 加入xx 微升终止液（Reagent E）
6． 放进80℃恒温培养箱或恒温水槽孵育30 分钟，避免干枯
7． 加入xx 微升反应液（Reagent F），混匀
8． 放进50℃恒温培养箱或恒温水槽孵育30 分钟，避免光照
9． 室温下孵育30 分钟，避免光照
10．转移到比色皿或酶标板
11．即刻放进荧光分光光度仪检测：获得样品相对荧光读数
12．根据标准曲线获得样品对应葡聚糖浓度
五、 计算样品活性
[根据标准曲线获得样品对应葡聚糖浓度（纳摩尔/升）X 样品稀释倍数]÷ X xx（分钟）＝皮摩尔/毫升/分钟
÷（样品蛋白浓度）毫克/毫升＝皮摩尔/毫克/分钟
3
注意事项
1． 本产品为25 次操作，包括标准样
2． 操作时，须戴手套
3． 强化液（Reagent B）为固体状，移取方法为：使用1 毫升枪头，将尖端部分剪去；或使用
0.5 毫升PCR 管的盖子内圈盛满；或秤重0.1 克
4． 终止液（Reagent E）具有腐蚀性，注意操作安全
5． 建议测定细胞裂解悬液的蛋白浓度，便于计算活性单位之需；建议使用－Bradford 蛋白质浓
度定量检测试剂盒（30030.1 ）
6． 荧光测定后，比色皿须清洗彻底
7． 酶活性单位浓度定义：在28℃室温下，pH 7.8 的情况下，每单位酶在单位时间内（每分钟）合成1 微
摩尔的葡聚糖
8． 待测样本为微粒体，其蛋白浓度为20 微克/5 微升；待测样本为细胞裂解悬液，其蛋白浓度为100 至
200 微克/5 微升（本公司提供 GENMED Bradford 蛋白质浓度定量试剂盒30030.1 ）
9． 如果待测样品浓度过高或过低，可以调整样品浓度
10．本公司提供系列真菌/酵母细胞酶学相关试剂产品
质量标准
1． 本产品经鉴定性能稳定
2． 本产品经鉴定检测敏感
版权声明