核桃源性成分染料法荧光定量PCR 试剂盒_产品说明_仪器仪表技术文献

核桃源性成分染料法荧光定量PCR 试剂盒

提供者：上海雅吉生物科技有限公司发布时间：2019/4/3 8:18:45 阅读次数：3716次进入该公司店铺

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低温运输，-20℃保存
核桃源性成分染料法荧光定量PCR 试剂盒
Walnut-Derived Material SYBR PCR Kit
使用手册V1.0
产品及特点本试剂盒可用于检测食品或其他材料中是否有核桃的成分。现代食品加工工艺极大
改变了食材原有的味道、气味、色泽、纹理和质地等特性，因此传统的感官鉴别技术已
经无法对食材的真伪进行准确的鉴定。同时部分食材还有致敏性，因此基于基因检测的
快速灵敏的食材来源检测技术将对食品监管和安全提供重要的保障。本产品就是为满足
这一需求根据PCR 原理开发的产品，它具有下列特点：
1. 即开即用，用户只需要提供样品DNA。
2. 根据核桃保守区域设计引物，能专一性地检测出样品中的核桃成分，但不能检测其
他非核桃成分。
3. 荧光定量PCR 检测，比常规PCR 更加灵敏。
4. 快速，整个检测过程（按一个样品计）所需时间仅为2.0 小时。
5. 一管式闭管操作，降低了交叉污染。
6. 提供阳性标准品，便于分析实验结果。
7. 对混合样品中核桃成分的检测下限为0.01%，对样品中核桃成分的核酸检测下限
为0.1ng/μL。
8. 本只能用于科研，足够50 次20uL 体系的荧光定量PCR。
规格及成分成分编号十孔盒包装（去纸托）
2×qPCR MagicMix 90408 0.5 mL（棕色）
荧光PCR 专用模板稀释液180701 1 mL（黄盖）
核桃源性成分PCR 引物混合液14-507yw 100 uL（白盖）
核桃源性成分PCR 阳性对照14-507pc 50 uL（黄盖）
DNA 释放剂试用装130982 50 次（成分见下）
免DNA 提取试剂溶液A 成分一130982a 50 uL（白盖）
免DNA 提取试剂溶液A 成分二130982 100uL（绿盖）
免DNA 提取试剂溶液B 130982c 400 uL（红盖）
使用手册13-510sc 1 份
运输及保存低温运输，-20℃保存，有效期一年。使用本试剂盒提供的阳性对照时，由于其浓度较
高，一定要注意不要污染其他试剂和成分。专门的区域操作。
自备试剂DNA 模板
使用方法一、稀释标准曲线样品（以10E2-10E7 拷贝/μL 这6 个10 倍稀释度为例）。由于标
准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，千万不能污染样品或本
试剂盒的其他成分）。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原，本产品不提供活体样
品做阳性对照，只提供无传染性的DNA 片段作为阳性对照。
1. 标记6 个离心管，分别为7，6，5，4，3，2。
2. 用带芯枪头分别加入45 μL 荧光PCR 专用模板稀释液，用带芯枪头，下同）。
3. 在7 号管中加入5 μL 阳性对照（浓度为1×10E8 拷贝/μL，试剂盒提供)，充分
震荡1 分钟，得1×10E7 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。
4. 换枪头，在6 号管中加入5 μL 1×10E7 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得)，
充分震荡1 分钟，得1×10E6 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。
5. 换枪头，在5 号管中加入5 μL 1×10E6 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得)，
充分震荡1 分钟，得1×10E5 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。
6. 重复上面的操作直到得到6 个稀释度的标准曲线样品。放冰上待用。
二、样品DNA 的制备
7. 用自选方法纯化样品的DNA，本产品跟市场上绝大多数核酸纯化产品兼容。
8. 如果有N 个样品，则需要进行N+2 个样品提取，多出的一个用作样品制备阳性对
照管、另一个用作样品制备阴性对照管。如果用本试剂盒自带的DNA 释放剂试
用装。则按下面步骤操作：
9. 配制溶液A 工作液。以配制1mL 工作液（足够10 个样品）为例：在一干净塑料
管中加入10uL 溶液A 成分一，20uL 溶液A 成分二和970uL 超纯水，充分混合
均匀即可。溶液A 工作液可室温放置，但在一周内用完，不要长期放置。一
次检测一个样品需要100uL 溶液A 工作液，1mL 工作液足够10 个样品。如果待
测样品数量为其他数字，配制的溶液A 工作液的体积需要做相应的调整。
10. 在标记好的N+2 个离心管中，加入1-5mg 固体样品（半粒芝麻大小）或5uL 液
体样品待测样品。在样品制备阳性对照中加入5uL 阳性对照，在样品制备阴性对
照中加入5uL 水。
11. 在每个管中加入100 uL 溶液A 工作液，确保固体样品被溶液淹埋，如果是液体样
品则震荡混匀。
12. 95℃保温10 分钟。
13. 待冷却到常温后加入10uL 溶液B 并混匀得DNA 释放液。每个样品得到的DNA
释放液足够进行50-100 次PCR。
三、设置qPCR 反应（20μL 体系，在样品制备室进行）
14. 如果只做1 次重复，则标记N+9 个PCR 管，其中N+2 个用于上步得到的N+2 个
样品，1 个用于PCR 阴性对照，6 个用于标准曲线样品（也充当PCR 阳性对照）。
如果做2-3 次重复，则反应设置数量相应增加2 或3 倍。
成分
样品管
N+2 个
PCR 阴性
对照管
标准曲线
样品管（2-7 管）
2×qPCR MagicMix
（棕色管）
各10 μL 10 μL 各10 μL
核桃源性成分PCR 引物
混合液（白盖）
各2 μL 2 μL 各2 μL
自备10×ROX (见注) 各2 μL 2 μL 各2 μL
待测样品DNA 模板各6 μL 不加不加
第7 步所得标准曲线样
品稀释液（2-7 号）
不加不加
各6μL（2 号样到
2 号管，3 号样到3
号管…）
过程温度时间
预变性94℃ 5 min
PCR 反应
（35 个循环）
94℃ 0.5 min
53℃ 0.5 min（采集SYBR 通道的
荧光信号）
72℃ 0.5 min
最后延伸72℃ 10 min
15. 在标记管中按下表加入各成分（本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设置完毕
后才设置阳性对照，并且阳性对照样品要等所有管子盖上盖子储存好后最后加）：
注:仅ABI7500、7700 和7900 仪器需要使用ROX 作为对照，其他荧光PCR 仪
器（如iCycler IQ、MJ Option、MJ Chromo4、MX3000、MX4000、RotorGene
3000、RotorGene 6000 和LightCycler480）不需要使用ROX，则用水替代。
16. 盖上盖子后上机，按下面参数进行qPCR（具体PCR 参数可以根据qPCR 仪器的
不同而自行优化）。
四、qPCR 反应参数
五、数据处理
17. 以阳性对照浓度的log 值为横轴，以Ct 值为纵轴，绘制标准曲线。再以待测样品
的Ct 值从标准曲线上推算出样品DNA 浓度的log 值，再推算出其浓度。
六、电泳检测
18. 如果有必要电泳确认，可取10-20 uL PCR 产物直接在琼脂糖凝胶上电泳产物的
大小为91bp。开盖电泳验证容易污染实验环境，强烈不建议采用此方法。
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