Annexin-V-FITC 单染法

实验方法原理细胞凋亡或称程序性细胞死亡（Programmed Cell Death ,PCD）是细胞的生命现象之一，它在机体的胚胎发育、组织修复及自身反应性T淋巴细胞的清除等方面起着十分重要的作用。细胞凋亡调节的失控可导致临床各种疾病的发生。如老年性痴呆与神经细胞凋亡过度有关，自身免疫性疾病和肿瘤与细胞凋亡的抑制有关。细胞凋亡有别于细胞坏死，它有一系列的细胞形态学和生物化学的改变，包括出现染色质浓缩、DNA降解、凋亡小体形成等。在正常的活细胞，磷脂酰丝氨酸（phosphotidylserine， PS）位于细胞膜的内侧，但在凋亡的细胞，PS 从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，暴露在细胞外环境中。Annexin-Ⅴ（膜联蛋白-V）是一种分子量为35-36KD的Ca2+ 依赖性磷脂结合蛋白，能与PS高亲和力结合。因此将Annexin-Ⅴ进行荧光素（如FITC、PE）或生物素（Biotin）标记，以标记了的Annexin-Ⅴ作为探针，利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生。

实验材料Annexin V-FITC

试剂、试剂盒标记缓冲液PBS去离子水冰块

仪器、耗材移液器吸头微量离心管可调速离心机载玻片盖玻片流式细胞仪或荧光显微镜

实验步骤

1. 凋亡细胞的制备

小鼠腹腔注射地塞米松25 mg/kg体重，10 h后解剖取胸腺，分离胸腺细胞。用PBS洗两遍，调整待测细胞的浓度为2×106 /ml，备用。

2. 200 μl细胞悬液加入1 ml冷PBS，轻轻震荡使细胞悬浮，1000 rpm 4 ℃离心10 分钟，弃上清。

3. 重复步骤2两次。

4. 将细胞重悬于200 μl 标记缓冲液。

5. 加入10 μl Annexin V-FITC，轻轻混匀，避光室温反应15 分钟或4 ℃反应30 分钟。

6. 加入300 μl标记缓冲液，立即上机（流式细胞仪）检测。

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注意事项

1. 整个操作过程动作要尽量轻柔，切勿用力吹打细胞，尽量在4 ℃下操作。

2. 反应完毕后要尽快检测，因为细胞凋亡是一个动态的过程，反应一小时后荧光强度就开始衰变。

3. Annexin V-FITC是光敏物质，在操作时要注意避光。

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其他

一、实验结果

用荧光显微镜观察，凋亡细胞细胞膜上可见黄绿色光环。PS转移到细胞膜外不是调亡所特有的，也可发生在细胞坏死中。以FITC标记的Annexin V, 可以同时结合使用PI（碘化丙啶）拒染法，用流式细胞仪分析可检测凋亡细胞的百分率。