由于巢式PCR反应有两次PCR扩增，从而降低了扩增多个靶位点的可能性（因为与两套引物都互补的引物很少）增加了检测的敏感性；又有两对PCR引物与检测模板的配对，增加了检测的可靠性。 由于第二套引物位于第一轮PCR产物内部，而非目的片断包含两套引物结合位点的可能性极小，因此第二套引物不可能扩增非目的片断。这种巢式PCR扩增确保第二轮PCR产物几乎或者完全没有引物配对特异性不强造成的非特异性扩增的污染。

巢式PCR反应模式图

实验材料基因样品

试剂、试剂盒PCR缓冲液Tris·HClKClTaq聚合酶

仪器、耗材PCR仪

实验步骤

1. 目标的DNA模板蓝色的第一对引物结合。第一对引物也可能结合到其他具有相似结合位点的片段上并扩增多种产物。但只有一种产物是目的片断（图中未显示可能的多种产物）。

2. 使用图中红色标记的第二套引物对第一轮PCR扩增的产物进行第二轮PCR扩增。

第一轮

1. 大小：1192 bp

2. 初始孵育：94℃4分钟

3. 变性：94℃45秒

4. 退火：58℃45秒

5. 聚合：72℃45秒

6. PCR循环：36

第二轮

1. 大小：271 bp

2. 初始温育：95℃2分钟

3. 变性：95℃45秒

4. 退火：60℃下45秒

5. 聚合：72℃30秒

6. PCR循环：36

收起

注意事项

1. 引物设计原则：每个特异性引物为24~26个碱基，Tm：64-65%，GC：44-55% 。这样你可以同时做多个不同的TAIL PCR。

2. 在第一轮PCR结束之后，将PCR产物稀释1 000倍（视情况而定）作为第二轮PCR的模板，第二轮PCR的产物同样稀释1 000倍（视情况而定）作为第三轮PCR的模板，这样依次类推。实际操作中可以搞3轮甚至更多，当然做3轮是比较合适了，这个时候PCR的产物已经是高度特异性了。

其他

1. 图解