试剂、试剂盒
浓硝酸
实验步骤
一、盖玻片的预处理
1. 玻璃盖玻片放在瓷染色架上，用蒸馏水冲洗。
2. 架子放在玻璃容器中，浓硝酸泡 48 小时。
3. MilliQ 水漂洗盖玻片 1 小时，重复 3 次。
4. 200℃ 烤 8 小时灭菌盖玻片。
5. 在层流柜中将盖玻片放在 60 mm 培养皿，外边缘放两粒（1~2 mm 高）融化的无菌 Paraplast。颗粒的大小决定了盖玻片和培养皿单层神经胶质细胞间的分离程度。
6. 加入 5 ml 过滤除菌的溶于硼酸缓冲液（0.1 mol/L，pH 8.5）的 1 mg/ml poly-L-lysine 溶液，室温过夜。
7. 无菌 MilliQ 水漂洗 1 小时。重复 3 次。
8. 吸出漂洗液，加 5 ml 接种培养基（MEM 加 10% 马血清），接种分离神经元之前放在 CO2 温箱中 37℃ 孵育至少 24 小时。
二、单层神经胶质细胞的制备
1. 去掉 1~3 天幼大鼠的头。
2. 在层流柜中从头颅骨上取下脑，放在盛有 BSS 的培养皿中。
3. 在解剖显微镜下取出脑半球，完全剥离脑膜、切碎脑组织，放入盛有 25 ml 0.25% 胰酶 BSS 溶液的 50 ml 组织培养管。
4. 37℃ 水浴孵育 30 分钟。
5. 小心吸出胰酶溶液，加 25 ml BSS，用巴斯德吸管吹散细胞。
6. 离心收集细胞（1000 r/min，10 分钟），悬于接种培养基中。
7. 计数细胞，悬液稀释至 200000 细胞/ml，取 4 ml 接种 60 mm 组织培养皿。
8. 24 小时后倒掉培养液，加 5 ml 新鲜培养液。
9. 每周换一次培养液，神经胶质细胞 70% 长满时即可用于共培养。
10. 制备神经元培养物时，提前一天更换神经元培养液，加 6 ml 维持培养液继续培养。
实验材料母鼠
试剂、试剂盒BSS
仪器、耗材无菌器械显微镜
实验步骤
1. 杀死怀孕 18 天母鼠（常用过量 CO2 使其窒息），用无菌器械取出胚胎，放在无菌的培养皿中。
2. 取下胚胎的头，放在盛有 4 ml 不含 Ca2+ 和 Mg2+ 的平衡盐溶液（BSS）的培养皿中。
3. 从头颅骨上取下脑，放在 35 mm 培养皿中的 BSS 液滴上，培养皿中半装满 Paraplast（Sigma）。
4. 在显微镜下剥离脑膜，取下海马体，放在装有 BSS 的 35 mm 培养皿中。
5. 海马体在新鲜配制的 0.25% 胰酶 BSS 溶液中 37℃ 孵育 15 分钟。
6. 小心吸掉胰酶溶液，加入 5 ml BSS，层流柜中室温放置 5 分钟。重复此步两次或更多次，最后加入 2 ml BSS。
7. 首先用普通巴斯德吸管分离细胞，然后换用一支用火烧平尖端、内径缩小一半的吸管。
8. 计数细胞，确定细胞密度。
9. 所需数目的细胞悬浮于接种培养基中，接种培养皿中 poly-L-lysine 预处理的盖玻片。如果用于生化实验，细胞直接接种 poly-L-lysine 处理的培养皿。
10. 2~4 小时后，盖玻片转移至含有单层神经胶质的培养皿中，培养皿中是维持培养基。
11. 每周更换 3 ml 培养液。
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