实验方法原理
实验材料CB-MNCs
试剂、试剂盒灭菌培养基过柱缓冲液FcR阻断剂CD34微球
仪器、耗材
柱子（MS+ RS+或LS+ VS+)磁珠细胞分离仪尼龙过滤网 30μm
实验步骤
(a)准备过柱缓冲液，用抽真空装置去除气体。
(b)每108个CB-MNCs用终体积300μL缓冲液重悬。
(c)每108个CB-MNCs悬液加100μL FcR阻断剂，抑制CD34微珠非特异性结合或通过Fc受体介导与非靶细胞的结合。
(d)每108个CB-MNCs悬液加100μL CD34微球进行细胞标记，充分混匀后在6〜12℃冰箱放置30min。
(e)加PBSA洗，室温200g离心10min;加适量的缓冲液重选细胞。
(f)根据CB-MNCs的细胞总数选择合适的柱子类型（MS+/RS+或LS+/VS+)，将柱子放人MACs分离仪的磁场中。加人缓冲液润洗柱子（MS+/RS+:50μL;LS+/VS：3mL)。
(g)用30μm的尼龙过滤网过滤细胞，去除细胞团。使用前，用缓冲液湿润柱子。
(h)将细胞悬液加人柱子，使未结合的细胞通过柱子。
(i)用缓冲液将未结合的细胞洗去（MS+/RS+:3×500μL;LS+/VS:3×3mL)。
(j)洗脱结合的细胞。将柱子从分离仪中移出。置于合适的管中。将柱子加满缓冲液（MS+/RS+:1mL;LS+/VS: 5mL)。用柱子随带的内塞，加压将结合的细胞冲洗出来。
(k)加PBSA将CD34+细胞洗一遍，室温200g离心l0min。用适当的培养基重悬细胞。
饲养层细胞共培养体外扩增CD34+细胞
实验方法原理
实验材料CD34+细胞
试剂、试剂盒灭菌MSCs培养基丝裂霉素C100μg mL共培养的培养基细胞因子（干细胞因子IL-6Flt-3配体促血小板生成素）
仪器、耗材6孔培养板
实验步骤
(a)将脐带血来源的间充质干细胞（blood-derived mesenchymal stem cells, CB-MSCs)作为饲养层细胞，用MSCs培养基重悬CB-MSCs，细胞浓度为5×104个细胞/mL。
(b)将CB-MSCs接种到6孔板
(C)每周两次半量更换新鲜培养基。
(d)当CB-MSCs达到以上汇合时，用10μg/mL丝裂霉素c处理,37℃ 2.5 h„
(e)用无血清IMDM将CB-MSCs洗两遍。
(f)按1×104个/mL CD34+细胞重悬于含细胞因子的共同培养基（100 ng/mL干细胞因子，100ng/mL IL-6,50 ng/mLFlt-3配体，10 ng/mL促血小板生成素）。
(g)将CD34+细胞接种到CB-MSCs饲养层细胞上。
(h)每周两次更换1/4培养基。
(i)2周后，收集未贴壁细胞。
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