原题目（翻译）：EMB琼脂和HiCrome大肠杆菌琼脂对都产生绿色金属光泽的非大肠杆菌与典型大肠杆菌鉴别能力的比较评估

原题目：Comparative Evaluation of EMB Agar ａnd Hicrome E. coli Agar for Differentiation of Green Metallic Sheen Producing Non E. coli ａnd Typical E. coli Colonies from Food ａnd Environmental Samples

出处：Journal of Pure ａnd Applied Microbiology. 2016,10(4)

特别是当这些竞争菌群数量都较多时，问题更为突出，结果使假阳性数量增多，降低了选择培养基的效率。但很少有人提出解决方案。目前有很多报道使用显色培养基分离肠出血性大肠杆菌O157:H7，但关于其他血清型的大肠杆菌的分离鉴别则很少。因此，应尝试采用更新的培养基和方法来快速、准确的分离这种指示菌，从而有助于避免错误的解读。

本文比较了一种显色培养基HiCrome E.coli琼脂（HiMedia，印度）和EMB琼脂在分离不同来源大肠杆菌的性能（HiMedia,印度）。相伴随的干扰菌群也进行了鉴定，并且与大肠杆菌进行了系统发生学上的比较。

材料与方法

细菌培养和标准菌株

本研究纳入了400株疑似大肠杆菌的分离株，它们来自不同样本：活蛤蜊（n = 140）、市场上的双壳贝类肉（n = 45）、水（n=100）和热带沉积物河口（n = 100）和饮用水（n=15）。

大肠杆菌ATCC 25922和4个其他菌株GenBank号为JX183939.1、JX183940.1、JX183941.1和JX183942作为标准参照菌株。

取样、分离和生化分析

按照标准指南进行样本无菌收集和处理（见注1）。大约25克贝类肉无菌转移到无菌的匀浆袋中，并在一个匀浆袋（IUL Instruments，西班牙）中与225毫升无菌蛋白胨水混合。使用5管含乳糖的肉汤对大肠杆菌分离株进行MPN检测。

同样，沉积物和水样也进行稀释（1：9比例），并按同样方法检查大肠杆菌的存在。在44.5°C温育24-48小时进行乳糖发酵的检测。从显示生长和产气的管中取样，用接种环在常规Levine＇s Eosin-methylene blue琼脂（L-EMB，Himedia，印度）或Hicrome大肠杆菌琼脂上划线。在37℃孵育24小时后观察平板。关于EMB，像大肠杆菌这样强烈产酸的菌落有绿色金属光泽，并显示中心黑色。在酸性条件下，染料伊红Y发生沉淀，产生黑色菌落。绿色金属光泽是由于伊红Y和亚甲基蓝之间形成酰胺键。另一方面，Hicrome大肠杆菌琼脂检测大肠杆菌是基于葡糖醛酸糖苷酶的存在。培养基中的显色底物p-硝基苯-p-D-吡喃葡萄糖醛酸（PNPG）被大肠杆菌吸收。大多数大肠杆菌（O157：H7除外）含有β-葡糖醛酸酶，能裂解显色底物发色团与葡萄糖醛酸苷之间的化学键，释放前者，产生蓝绿色菌落。在测试样品之前，使用五种标准菌株，在控制条件下，对两种培养基的有效率进行了评估。EMB琼脂和Hicrome大肠杆菌琼脂都是100％。典型菌落采用IMViC试验进行了生化鉴定，包括吲哚产生试验，甲基红试验，伏普试验和柠檬酸盐利用试验。

检测uid A基因进行分子验证（略）

大肠杆菌的血清分型（略）

16S rRNA扩增测序（略）

系谱发生分析（略）

统计学分析

%灵敏度 = 真阳性 x 100 / (真阳性+ 假阴性)

%特异性 = 真阴性 x 100 / (真阴性+假阳性)

% 有效率 = (真阳性 + 真阴性) x100 / 全部

结果和讨论

EMB琼脂和Hicrome大肠杆菌琼脂在五种标准菌株的识别中显示出100％的有效率（数据未提供）。然而，在天然样品中，当都产生金属光泽的非大肠杆菌和真正的大肠杆菌都存在时，问题就来了。两种培养基分离鉴定大肠杆菌的结果见表1和表2。在EMB琼脂上假阳性率非常高（40％），而在Hicrome上则非常低（0.5％）。 假阴性在EMB琼脂上也很高（15.75％），这是由于真正的大肠杆菌被高度粘液状背景菌群所掩盖，而在Hicrome大肠杆菌琼脂上，没有检测到假阴性（表1）。同时，Hicrome的灵敏度、特异性和有效率远远高于Levine’s

EMB琼脂（表2）。

大肠杆菌和非大肠杆菌在HiCrome大肠杆菌琼脂和EMB琼脂上的生长状况

真正的大肠杆菌在EMB琼脂上产生非常亮的金属光泽菌落，在Hicrome大肠杆菌琼脂产生蓝绿色菌落（图1）。相反，在EMB上大量典型的具有亮金属光泽的大肠杆菌疑似菌落，在Hicrome大肠杆菌琼脂上为白色菌落。生化鉴定显示，它们不是大肠杆菌（图2）。实验还观察到，如果样品中大肠杆菌的浓度较低，其光泽就会被高粘液状背景菌群如克雷伯氏菌所掩盖（图3），导致假阴性结果，它可以通过使用Hicrome大肠杆菌琼脂进行有效区分。

图1a. EMB琼脂上产生亮金属光泽的大肠杆菌菌落

图1b. HiCrome E. coli agar上的蓝绿色大肠杆菌菌落

图2a. EMB琼脂上产生亮金属光泽的假阳性的非大肠杆菌菌落

图2b. 相应菌落在HiCrome E. coli agar的形态颜色

图3a. EMB琼脂上的干扰菌落

图3b.相应菌落在HiCrome E. coli agar上。蓝绿色真正大肠杆菌的菌落与白色菌落的干扰菌群可以清楚的区分

表1

表2

分离株的生化特征

EMB琼脂上的亮金属光泽菌株显示出6种不同的IMViC反应（表3）。前两种反应为真正的大肠杆菌，其他反应为非大肠杆菌。

表3

分离株的分子验证

所有生化证实为大肠杆菌的菌株，其uid A基因均为阳性，其余四组生化反应对应的菌株uid A基因扩增阴性

16s rRNA扩增和测序

前2个生化反应对应的菌株再次验证为大肠杆菌。后面四组类型的非大肠杆菌鉴定为阿斯肠杆菌(E19), 佐治亚克吕沃尔菌(E3), 成团泛生菌(E 30) 和固氮植物菌（Phytobacter diazotrophicus） (2ss1B3)，全都属于肠杆菌科成员。

系谱发生分析（略）

大肠杆菌的血清分型

分离株发现有20个血清型，包括肠出血性O157：H7（3.5％），产肠毒素O8（8％），产志贺毒素O121（4.5％），肠侵袭性O124（0.5％）和肠致病性O91（0.5％）血清型。从HiCrome大肠杆菌琼脂分离出²-D-葡萄糖醛酸酶阳性非典型大肠杆菌O157：H7菌株，它本来会被忽略，因为培养基只检测葡萄糖醛酸酶阴性的典型分离株（注2）。 其他血清型包括O2，O4，O9，O17，O27，O33，O34，O35，O84，O118，O119，O120，O126，O141和O156。

该研究证明了Hicrome大肠杆菌琼脂（99.5％）对EMB琼脂（44.25％）的诊断效率。同样，Hicrome大肠杆菌琼脂灵敏度和的特异性也很远高于EMB琼脂（表2）。增加EMB琼脂的假阳性率，使得分离这个简单的有机体十分繁琐，需要挑取太多的菌落，最终在遗失真正阳性菌落的同时，只发现出很少的阳性菌落或根本没有阳性菌落（图2和图3）。

经常观察到从EMB琼脂中分离出来大肠杆菌，与其他菌群具有很强的关联，其生长逐渐会超过大肠杆菌，而导致最初要分离菌株的逐渐减少。这种现象可以通过使用显色培养基来克服或大大减少。大部分的从EMB中分离出的假阳性属于肠杆菌科，它提示EMB琼脂从其他表型特征近似的肠杆菌科中鉴别出大肠杆菌的效率较低。以前有报道称柠檬酸杆菌属，肠杆菌属，伤口埃希氏菌，栖冷克吕沃尔氏菌、哈夫尼菌属、克雷伯菌属、拉恩氏菌属和沙雷菌属在EMB琼脂上也形成大肠杆菌样的的假阳性菌落。但据我们所知，这是第一份报告阿斯肠杆菌，佐治亚克吕沃尔菌和固氮植物菌（Phytobacter diazotrophicus）在EMB琼脂上形成假阳性菌落。

结论

尽管Hicrome大肠杆菌琼脂比EMB琼脂价格更高，但当所有因素都考虑时，显色培养基则是更有效、更快速和经济的方法，可以节省时间和钱。 简而言之，这种培养基是强力推荐用于菌落数量较多的样品，因为它的准确度和简单性，即使经验不足的实验室人员也可以确定其鉴定结果，而无须再进一步的确证性生化或分子检测。

注1. American Public Health Association: Recommended Procedures for the Examination of Seawater ａnd Shellfish, 4th ed. APHA, Washington, DC, 1970.

American Public Health Association: Compendium of Methods for the

Microbiological Examination of Foods, 3rd ed.APHA, Washington, DC, 1992.

Bacteriological Analytical Manual: Chapter 4, Enumeration of Escherichia coli ａnd the Coliform Bacteria, 2002. http://www.fda.gov/Food/FoodScienceResearch/LaboratoryMethods/ucm064948.htm

注2.Manafi, M., Kremsmaier, B. Comparative evaluation of different chromogenic/fluorogenic media for detecting Escherichia coli O157:H7 in food. Int. J. Food Microbiol., 2001; 71: 257–262