微流控免疫磁珠细胞分选系统样本采集

　　采集外周血液10 mL，收集后立刻将抗凝管上下颠倒混匀，避免血液凝固，标本放在4 ℃ 冰箱中6 h内处理。

　　1.2微流控免疫磁珠细胞分选系统 全血处理

　　在50 mL的Leucosep管内加入 15.2 mL FicollPaque分离液，300×g离心力，离心5 min，离心后，Ficoll沉至管底。将10 mL血液样本沿着管壁缓慢加入Leucosep管内，再分别取10 mL PBS润洗采血管2次，以便充分收集残余在管壁的血液样本，1 000×g离心10 min;离心后，将血浆和血细胞层吸入另一个50 mL离心管内，300×g离心8 min;小心吸去上清，得到血液细胞。

　　1.2.3 血细胞处理

　　在血液细胞内加入40 μL 封闭液，吹吸均匀，封闭5 min。将样本移至加入5 μL磁珠的EP管内，加入400 μL Binding Buffer。颠倒混匀数次后将EP管放入摇床，置于4 ℃冰箱，使磁珠与细胞充分孵育1 h。

　　1.2.4 细胞分选

　　在微流控试剂仓清洗孔中加入2 mL 结合液(binding buffer)，微流控免疫磁珠细胞分选系统选择仪器控制面板的“初始化”，仪器产生电动控制压(2psi)，使结合液从清洗孔中进入仓底部的微流管道，最终进入“废液收集孔”(图 1A)。此步骤目的是去处管道中的气泡，为细胞分选做准备。

　　微流控免疫磁珠细胞分选系统的简介：

　　用微流控免疫磁珠细胞分选系统是高效简捷的免疫细胞及其它细胞的分离纯化方法。

　　原理是已包被一抗的磁珠与细胞表面相应分子 特异性结合，

　　或者已包被二抗(羊抗小鼠或羊抗大鼠)的磁珠与预先已与细胞表面分子特异结合的一抗结合。

　　磁珠携带与之结合的细胞吸附于分离柱/试管上，实现阳性细胞分离或阴性细胞的分离。

　　微流控免疫磁珠细胞分选系统、用分离柱阳性分选细胞的方法。

　　1.如果分离细胞用作培养，全过程在超净台中完成微流控免疫磁珠细胞分选系统。

　　2.超微磁珠及微小磁场系统适合于少量细胞分离，通常已适用于大多数实验研究;此外各公司尚有大磁珠及大磁场供应，可用于更大量细

　　胞的分选;除分离柱外，也有试管及其它设备用于分选;根据我们应用的经验，分离柱由于提供了较大的接触面，在细胞分选上具有较

　　多优点。磁场也可以自制，用一般的磁铁即可做成简易磁场，可提供足够的磁力。

　　3.磁珠分离系统分离的细胞纯度可以达到80~99%，得率在60~90%左右，仅次或相当于流式细胞仪(FACS)的分选效率，与FACS 相比，MACS设备简单，耗时极短，故而应用广泛。MACS也可用做FACS分选前的预分离，以减少FACS所用时间。另外连续两次过柱分选可进一步提高分选细胞纯度，通常可达95-99%。

　　4.微流控免疫磁珠细胞分选系统在分离柱尾接上限速针头，收集的首次流下的细胞即为阴性选择细胞，一般纯度低于阳性选择。

　　5.分离柱一般只能一次应用，再用时降低分离效率;

　　6.分选下的细胞可用荧光标记抗体(一抗或二抗)标记后FACS鉴定纯度;我们用荧光抗体直接标记细胞后，用二抗包被磁珠分选出细胞，

　　直接做FACS分析，也可实现分选和纯度检测。分选的效率在很大程度上取决于实验者对关键环节的把握。我们建议实验者在操作前认真

　　阅读相应的说明书及以下特别值得提出引起重。

　　微流控免疫磁珠细胞分选系统的有以下几点：

　　1.微流控免疫磁珠细胞分选系统待分选细胞中如有贴壁细胞，建议在分选前先贴壁培养去除，或者提高EDTA浓度;

　　2.抗体包被磁珠对死细胞常有非特异性结合。因而分选前去除死细胞;

　　3.新鲜分离骨髓细胞，先用胶原酶、DNA酶、胰酶联合消化，可使细胞团块解聚，从而提高分离效率。

　　4.微流控免疫磁珠细胞分选系统上分离柱前，充分振荡，混悬细胞，打散细胞团块;

　　5.用分离柱分选，应用真空抽滤水，减少水中气泡，使分离柱不被气泡阻滞;

　　6.细胞悬液加入分离柱中时，应将滴管伸至底壁后加入，微流控免疫磁珠细胞分选系统的避免将细悬液沿管壁流入，

　　使管壁残流末分选细胞，以致后继洗柱过程中，因疏忽末被洗下，

　　最后导致纯度不高。洗柱时，应在前次液体充分流尽后，再加洗液。

　　7.分选细胞量应根据说明书控制，不超量;

　　8.孵育时间和温度应按说明书进行，延长孵育时间、提高温度会增加非特异结合;

　　9.先用抗体阻断Fc受体，可降低非特异性结合;