①：ELISA实验中样品都要做复孔或三孔，然后计算每个浓度标准品的平均OD值，复孔的变异系数应该小于20%。

②：平均OD值减去空白孔的OD值。

③：制作标准曲线。

以减去本底后的OD值为X轴，标准品的浓度为Y轴，利用作图软件得出一个合适的计算方法。建议使用合适的软件来作图，比如CurveExpert 1.4。这款软件能够给出很多种方法(比如直线、半对数、对数、四参数方程等)并从中选择一条最合适的方程。要想检验某条曲线是否与表中数据吻合，可以将标准品的浓度作为未知数，将对应的OD值带入该方程，计算出标准品的浓度，得到的结果应该与实际浓度很接近(+/-10%)。选择拟合度最高的那条曲线。

如果出现标准曲线的线性不好，或平行性不好(双孔对照孔的OD值差别很大)，或出现跳孔的现象，可能引起的原因有酶标板孔间相互污染、洗板后未能尽快进行下一步操作、添加样品或其它试剂时操作的方法不对、孵育位置避光性不佳或盖板膜没有密封好使得水分蒸发、酶标板孔问加入的试剂量不同，相对应的解决办法是加样时请小心勿将液体溅人另一孔中，人工洗板时也请小心，勿将洗涤液溅人另一微孔中、在洗板后及时进行下一步操作、添加试剂时请悬空滴入，切记勿将枪头接触到板孔内，吸取不同试剂瓶中的液体时就要更换一次枪头、确认孵育环境不透光，盖板膜将酶标板密封好、使用已校正过的微量加样器，如将第一次加入液体时枪头上留有一滴的液体滴下，那么将以后枪头上留有的液体也滴下，以保证加入液体体积的一致性。

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