免疫组织化学技能制片的标准和质量操控　_技术交流_仪器仪表技术文献

免疫组织化学技能制片的标准和质量操控　

提供者：上海研域仪器设备有限公司发布时间：2017/7/17 10:40:57 阅读次数：305次进入该公司店铺

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影响免疫组化染色成果的要素有许多，除了免疫组化染色操作要素外，还包含安排切片制备各个环节的要素。因而，免疫组化技能的操作标准也要包含安排切片技能的标准。
一、免疫安排化学技能对安排切片的请求
免疫安排化学技能适用于冰冻切片和白腊切片，有些抗体只能用于冰冻切片，大有些抗体可用于白腊切片，适用于白腊切片的抗体也适用于冰冻切片。冰冻切片能极好地保留
安排抗原，抗原丢掉少，但形状构造差，定位不很明晰；白腊切片安排形状构造好，定位明晰，但在安排的固定、脱水、包埋等过程中简单损坏安排抗原，使抗原的免疫活性有所
下降。因而在检查白腊切片安排抗原时，尽也许保留安排抗原的免疫活性十分重要。
二、安排的固定
安排离体今后应及时选材固定，安排通过固定后可保留安排原有的形状构造，防止安排抗原弥散。常用的固定液为10％福尔马林液（4%甲醛液），最好选用10％中性福尔马林液
，固定时刻为4-6小时，通常不超越24小时。固定时刻缺乏，安排构造不佳，安排抗原弥散；固定时刻过长，可关闭或损坏安排抗原。
冰冻切片常用的固定液为无水丙酮或4%多聚甲醛，固定时刻为10-20min。
三、载玻片的处理
安排切片贴在载玻片上进行免疫安排化学染色，因为染色过程操作过程及冲刷次数较多，简单呈现脱片景象，因而将载玻片涂胶或硅化是必要的。较常用效果较好的是硅化玻
片。
硅化玻片的制备：
1. 载玻片经酸洗，冲刷干净后烤干。
2. 2％APES丙酮溶液浸1-2min。
3. 无水丙酮液浸1-2min。
3. 蒸馏水浸洗1-2min。
4. 烤干备用。
可用无水酒精代替无水丙酮，也能够直接配成APES水溶液运用。
＊ APES（3-AMINOPROPYLTRIETHOXY-SILANE）氨丙基三乙氧基硅烷 SIGMA商品。
四、安排切片前处理
经福尔马林溶液固定，白腊包埋的安排在固定过程中，安排中的抗原蛋白与甲醛发生交联，使得安排中抗原的决定簇被关闭，抗体难以和抗原充沛联系。因而要进行安排切片
前处理，意图是翻开安排抗原蛋白与甲醛的交联，暴露安排抗原，以进步安排抗原的检出率。安排切片前处理（也称抗原修复）常用的办法主要有：
1. 胰蛋白酶消化法
将切片置入胰蛋白酶消化液（0.1％胰蛋白酶 0.1％氯化钙水溶液 pH7.8）消化30分钟，37℃。
2. 水煮法
将切片置入蒸馏水内，加热至欢腾持续10分钟，天然冷却。
3.微波加热法
惯例是将切片置入0.01mol/L pH6.0的柠檬酸缓冲液内，用微波炉最大功率（约800W）加热10分钟，天然冷却。
4. 高压加热法
用高压锅加热0.01mol/L pH6.0的柠檬酸缓冲液至欢腾，放入切片，盖紧高压锅盖，持续加热至减压阀喷气，计时90秒钟至2分钟，天然冷却。
5.联合处理法
按上述办法先进行胰蛋白酶消化，然后再进行水煮法或微波加热法或高压加热法。
是不是进行切片前处理要按榜首抗体说明书的请求，切片前处理通常能够进步免疫组化染色的阳性率，但并非一切的抗体染色均需求前处理。切片前处理不妥会呈现：假阳性、假阴
性或阳性定位改动
五、内源性过氧化物酶的消除
安排中的粒细胞、单核细胞及红血球等存在内源性过氧化物酶，可与显色剂DAB、AEC起反响而造成假阳性，因而，在显色前要把这些内源性过氧化物酶消除，办法是用3％过氧
化氢效果15分钟。操作能够在加一抗之前也能够在加一抗以后。
六、内源性生物素的消除
安排细胞中存在着内源性生物素，在运用与卵白素联系或生物素符号抗体的免疫组化检查体系检查安排细胞中的抗原时，内源性生物素简单与ABC法中的卵白素（avidin）或S
-P（LSAB）法中的链霉菌抗生物素蛋白（streptavidin）联系，致使假阳性。因而在加一抗之前或在加一抗以后需求消除内源性生物素。消除内源性生物素的办法有：（1）用鸡蛋
清或卵白素关闭。（2）选用不含卵白素或生物素的免疫组化检查体系检查如Envision/Elivision二步法和EPOS一步法等。
七、高灵敏免疫组化染色办法的选用
免疫安排化学技能的特点之一是灵敏性高，即是能把抗原抗体联系物特异性地扩大。现在，免疫组化染色办法有一步法，二步法和三步法。通常来说，抗体与抗体的衔接过程
少，特异性高，灵敏性低；反之，衔接过程多，特异性低，灵敏性高。可是，不一样公司出产的试剂盒，技能因为不断地改善和进步，在特异性和灵敏性方面各有特点。各试验室可
以依据自个的实际情况对照比较，合理选用。现在运用最广泛的是S-P（LSAB）三步法和Envision/Elivision二步法。同一种染色办法，因检查试剂盒的不一样其灵敏性不一样，榜首抗
体的稀释度也不一样。
八、榜首抗体与免疫组化检查体系的精确配套
常用的榜首抗体通常为单克隆（鼠抗）和多克隆（兔抗）抗体，也有羊抗的抗体。常用检查试剂盒中的第二抗体也有分为抗鼠、抗兔或抗羊免疫球蛋白，不能错配，否则一抗
、二抗衔接不上而致使假阴性的染色成果。最好选用既含抗鼠又含抗兔和抗羊免疫球蛋白的抗体。
九、酶标抗体体系中的酶与显色剂的合理选用
在S-P等常用免疫组化办法中，符号抗体的酶主要有辣根过氧化物酶（HRP）和碱性磷酸酶（AP或AKP），显色剂有DAB、AEC、固红和固蓝等。在HRP体系用DAB和AEC作显色剂，DAB显
色阳性物呈棕色，AEC呈赤色；AP体系用固红、固蓝或BCIP/NBT作显色剂，固红显色阳性物呈赤色，而固蓝、BCIP/NBT呈蓝色。DAB显色形成的沉淀物最安稳和不易褪色，较为常用
，因其是致癌物，故要防止触摸肌肤和污染环境。
在多重免疫组化染色中，合理选用酶标抗体检查体系和显色剂，在同一切片上能够明晰地显示安排细胞中多种抗原的表达。
十、试验对照的设置
为证明抗体和检查试剂盒效价是不是牢靠，染色操作是不是精确，通常需求进行试验对照，以防止试剂失效或操作失当而呈现假阴性和假阳性，确保染色成果的牢靠性。
1.阳性对照：选用已知染色中度阳性以上的安排切片染色，阳性切片应呈阳性，此外安排中的内对照也是极好的阳性对照。初学者更应设阳性对照。
2.阴性对照：选用已知染色阴性的安排切片染色，其成果应为阴性，通常来说，阴性对照和阳性对照一起进行，或其中有阳性染色成果时才有含义。
十一、免疫安排化学染色后的布景复染
免疫安排化学技能的另外一个特点是抗体在安排中的定位精确。因而，免疫安排化学染色后需求复染细胞核，以将安排细胞构造显示出来，使免疫安排化学染色成果定位明晰
。免疫安排化学染色成果依据显色剂的不一样而不一样，有棕色、蓝色和赤色，复染细胞核的色彩也因染液不一样而不一样，通常有蓝色（苏木素）、绿色（甲基绿）和赤色（核固红）三
种。应依据色彩比照明晰的准则进行调配，常用的是DAB显色呈棕色，Mayer~s苏木素复染细胞核呈蓝色。甲基绿复染细胞核，色彩艳丽，格外适用于显微照相，但简单腿色。
十二、免疫组化染色成果的观察
1. 阳性成果应定位在细胞中相应的部位，在细胞膜表达的抗原阳性成果应
定位在细胞膜上，在其他部位的阳性反响均为非特异性染色。不妥的安排切片前处理睬致使抗原在安排细胞中定位的改动。依据所检查抗原的不一样，抗原别离定位在：（1）细胞膜
如LCA和UCHL1等。（2）细胞浆如Keratin和Lysozyme等
（3）细胞核如PCNA和ER、PR等
2. 不妥的安排切片前处理有也许呈现假阳性或假阴性的成果。
3. 安排的周边、刀痕、皱折等部位通常呈阳性反响，但绝大多数都是非特异性染色。
4. 染色成果呈阴性并非都是抗原不表达，要考虑是不是与安排中的抗原受到损坏有关。
5. 安排切片布景深与下列要素有关：
（1）榜首抗体浓度太高或孵育时刻过长，温度过高。
（2）显色剂DAB浓度过高或H2O2太多。
（3）正常血清关闭以后、滴加榜首抗体之前用了PBS洗。
（4）抗体纯度不高。
（5）抗体孵育切片后冲刷不干净。
十三、抗体的保留和稀释
抗体应于低温保留，榜首抗体可分红小包装于-20℃保留，运用时存放在4℃，不宜重复存放于4℃和-20℃之间。检查试剂盒通常存放于4℃，不宜于-20℃保留，如长时刻不必
可存放于-20℃，解冻运用后则不能再存放于0℃以下，因为重复冻融使得与抗体联系的酶简单离解，致使检查的灵敏度下降。
浓缩的抗体在染色前应依据说明书请求或自行探索出的最好作业浓度进行稀释。平时作业量不多时，可将抗体稀释至1:5-20，染色前再稀释成作业液。浓缩液抗体保留的时刻
较长，反之稀释后的抗体保留的期限较短，如运用即用型抗体，通过一定时刻后应注意其效价是不是有所下降，防止呈现假阴性染色。抗体稀释液可用商品化的抗体稀释液，也能够
用0.01mol/L PBS（ pH7.4），在PBS中参加1％BSA和10％正常血清后稀释抗体，对减轻非特异性布景染色有所协助。
十四、其它注意事项
1．白腊切片脱蜡要彻底。
2．抗体孵育时刻随孵育温度增加而减少，但通常不超越37℃；假如不是因为确诊急需，一抗置于4℃孵育过夜也是一种较佳的挑选。
3．滴加抗体应完全掩盖安排，防止致使安排边缘效应。