1、请等2× FlashPfu PCR Buffer (with Mg2+)完全溶解后再配制PCR反应体系。

2、为了获得最佳的扩增效果，扩增前的所有操作请在冰上进行。在室温下，聚合酶活力可能会产生非特异性扩增。并且请将FlashPfu DNA Polymerase最后加入反应体系，以避免酶的3’→5’核酸外切酶活力导致引物降解。

3、本产品扩增产物的克隆请按照平头末端克隆方法操作。

4、引物设计：

1）引物Tm值计算请使用最邻近法（Nearest Neighbor method）。请不要使用其他计算方法，它们计算得到的Tm值偏低，不适合本产品。

2）引物长度控制在20−35碱基，并且Tm > 60°C。

3）引物的GC含量最好控制在40−60%。

4）在引物3’端以G或C结尾，可提高引物和模板结合效率。但是要避免3’端避免有多个G或C，防止非特异性结合。

5）正、反引物的Tm之差不要大于5°C。

6）正、反向引物的3’端避免相互互补。

7）扩增长片段时，引物长度控制在25−35碱基。

8）进行定点突变时，请将错配碱基靠近5’端。若错配碱基靠近3’端，可能会受本酶校正。

不要使用含有尿嘧啶和次黄嘌呤核苷的引物。