上海劲马不仅从事酶联免疫试剂盒的研究与开发，我司对免疫组化也涉及其中，并且多次试验，累计了很多今年经验，本章小编就技术文章中为大家具体解析ELISA实验中染色问题分析及解决办法总结，欢迎阅读赏析。

问题一：染色过强

原因及相关解决方法：

a 抗体浓度过高或孵育时间过长 降低抗体滴度、抗体孵育时间：室温1小时或4度过一夜

b 孵育温度过高超过37度 一般在室温20-28度

c DAB显色时间过长或浓度过高 显色时间不超过5-12分钟，以显微镜下观察为准

问题二：非特异性背景染色

原因及相关解决方法：

a 操作过程中冲洗不充分： 每步冲洗3次每次5分钟

b 组织中含过氧化物酶未阻断 ：可再配置新鲜3%H2O2封闭孵育时间延长

c 组织中含内原性生物素：正常非免疫动物血清再封闭

d 血清蛋白封闭不充分：延长血清蛋白封闭时间

问题三：”染色弱

原因及相关解决方法 ：

a 抗体浓度过低、孵育时间过短：提高抗体浓度、孵育时间不能少 于60分钟

b 试剂超过有效使用时间： 应更换试剂

c 操作中添加试剂时缓冲液未沥干 ：每步滴加试剂前沥干切片中多余的缓冲液

使试剂稀释 （应防止切片干燥）

d 室温太低 ：低于15度要改放在37度孵育箱孵育30-60分钟或4 度冰箱过一夜

e 蛋白封闭过度：封闭不要超过12分钟

问题四：染色阴性

原因及相关解决方法

a 操作步骤错误：应重试设阳性对照

b 组织中无抗原：设阳性对照以验证试验结果

c 一抗与二抗种属连接错误：仔细确定一抗二抗种属无误