一、准备工作
准备工作对开展细胞培养异常重要,工作量也较大,应给予足够的重视,准备工作中某一环节的疏忽可导致实验失败或无法进行.准备工作的内容包括器皿的清洗、干燥与消毒,培养基与其他试剂的配制、分装及灭菌,无菌室或超净台的清洁与消毒,培养箱及其他仪器的检查与调试,具体内容可参阅有关文献.
二、取材
在无菌环境下从机体取出某种组织细胞,经过一定的处理(如消化分散细胞、分离等)后接入培养皿中,这一过程称为取材.如是细胞株的扩大培养则无取材这一过程.机体取出的组织细胞的首次培养称为原代培养。
三、培养
将取得的组织细胞接入培养瓶或培养板中的过程称为培养.如系组织块培养,则直接将组织块接入培养器皿底部,几个小时后组织块可贴牢在底部,再加入培养基.如系细胞培养,一般应在接入培养器皿之前进行细胞计数,按要求以一定的量接入培养器皿并直接加入培养基.细胞进入培养器皿后,立即放入培养箱中,使细胞尽早进入生长状态.
正在培养中的细胞应每隔一定时间观察一次,观察的内容包括细胞是否生长良好,形态是否正常,有无污染,培养基的PH是否太酸或太碱,此外对培养温度和CO2浓度也要定时检查.
四、冻存及复苏
为了保存细胞,特别是不易获得的突变型细胞或细胞株,要将细胞冻存.冻存的温度一般用液氮的温度－196℃,将细胞收集至冻存管中加入含保护剂的培养基,以一定的冷却速度冻存,最终保存于液氮中.在极低的温度下,细胞保存的时间几乎是无限的.
复苏一般采用快融方法,即从液氮中取出冻存管后,立即放入37℃水中,使之在一分钟内迅速融解.然后将细胞转入培养器皿中进行培养.
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