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蛋白表达常见问题分析

提供者：南京亿迅生物科技有限公司发布时间：2017/2/28 15:16:56 阅读次数：3874次进入该公司店铺

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　影响蛋白表达有许多因素，如目的蛋白自身的特点，表达载体、表达菌株的组合，诱导表达的条件，培养基的选择等，都有可能对蛋白的表达产生影响。针对蛋白表达中的一些常见问题，可尝试用如下方法加以解决。
一、蛋白不表达或表达量很低
1.选择正确的表达载体与表达菌株
基于T7 启动子的载体(如pET 系列载体)应选用BL21(DE3)、BL21(DE3)pLysS、Rosetta(DE3) 等菌株不是基于T7 启动子的表达载体(如带有tac 启动子的pGEX、pMal 系列表达载体)应选用BL21 表达菌株。
对细胞有毒性的蛋白，应该选用背景表达低、严紧调控诱导的菌株，如BL21(DE3)pLysS 菌株。对于带有稀有密码子的蛋白或来源于真核基因的蛋白，应该选用Rosetta(DE3) 等菌株。
2.尝试不同的表达系统与菌株
不同的蛋白，对不同载体与菌株的偏好不同，如果某一表达系统无法通过优化诱导表达条件得到明显改善，可以更换其它的菌株或表达载体。
3.表达条件的优化
选择不同的培养基。对于某些蛋白，在培养基中加入适量的葡萄糖(0.1%~0.5%)，可以明显提高表达量。
较高的温度、较高的诱导物浓度、较长的表达时间，一般可以加快表达的速度，促进目的蛋白的积累，从而提高表达量。但是可能会降低可溶蛋白的表达量，形成包涵体。
菌体的生长状态对蛋白表达有很的影响，可以通过测量菌液的OD 值监测生长状态。对于部分蛋白，应在菌液的对数生长期(OD ≈ 0.5)进行诱导。
二、目的蛋白不可溶，形成包涵体
首先确认目的蛋白是否有表达。裂解菌体并离心后，通过对全菌、上清、沉淀的检测，确认目的蛋白是否表达，还是形成了包涵体。
包涵体的形成与蛋白自身结构、表达系统、诱导表达条件等因素有着密切关系。在无法改变蛋白自身结构的情况下，可以尝试不同的表达系统与菌株，增强其溶解能力，优化出适合特定蛋白的表达系统。
目前认为包涵体的形成是基于蛋白在菌体内积累速度过快，没有正确折叠而聚集沉淀。可以通过优化诱导表达条件，减缓蛋白的积累。如：降低诱导温度、降低诱导物浓度、缩短表达时间、降低诱导时菌液的OD 值。