真菌DNA的提取操作方法

1.实验试剂

(1)DNA提取液：0.2M Tris-HCl(pH 7.5)，0.5M NaCl，0.01M EDTA，1%SDS

(2)3M NaAc

(3)TE：10 mmol/L Tris-HCl pH8.0，1 mmol/L EDTA

(4)酚(pH8.0)::异戊醇(25:24:1)

(5):异戊醇(24:1)

(6)异丙醇

(7)无水乙醇

(8)75%乙醇

(9)RNAseA

2.实验步骤

(1)取真菌菌丝0.5g, 在液氮中迅速研磨成粉

(2)加入4mL提取液，快速振荡混匀

(3)加入等体积的4mL的:异戊醇(24:1)，涡旋3～5min(此处是粗提没有加酚，可以节约成本)

(4)1000rpm，4℃，5min

(5)上清用:异戊醇(24:1)再抽提一次(10,000rpm，4℃离心5min)

(6)取上清，加入2/3倍体积的-20℃预冷异丙醇或2.5倍体积的无水乙醇沉淀, 混匀, 静置约30 min

(7)用毛细玻棒挑出絮状沉淀，用75%乙醇反复漂洗数次，再用无水乙醇漂洗1次，吹干，重悬于500ul TE中

(8)加入1ul RNaseA (10mg/mL)，37℃处理1h

(9)用酚(pH8.0)::异戊醇(25:24:1)和:异戊醇(24:1)各抽提1次(10,000rpm，4℃离心5min)

(10)取上清，1/10V 3M NaAc，2.5V体积的无水乙醇，-70℃沉淀30min以上

(11)沉淀用75%乙醇漂洗，风干，溶于200ul TE中，-20℃保存备用