血清这种或者抑制或者额外刺激斑点的性质，很让人困惑。以前人们推测是因为血清里面含有各种牛的细胞因子，它与其它种属的细胞因子受体有交叉反应，可以激活或者抑制相应的待检测细胞。现在对于TLR受体及其信号机制了解更深刻之后，似乎内源性TLR供体是一个更可能的原因。TLR供体不仅仅指来源于外源的病原体，哺乳动物自身可以表达一系列的TLR供体而激活TLR信号通路。这些内源性的TLR供体包括IL-1α、IL-1β、β-defensin2、HSP60、HSP70、Fibirinogen、透明质酸上的寡糖（Oligosaccharides of hyaluronic acid）、一种纤维连接蛋白上的结构域（Type III repeat extra domain A of fibronectin）、肝素上的多糖（Polysaccharide fragment of heparan sulphate）、CpG染色质IgG2a复合体。（Jiang, Z. et. al., 2003；Bulut, Y. et. al., 2001；Biragyn, A. et. al., 2002；Okamura, Y. et. al., 2001；Johnson, G. B. et. al., 2002；Xu, H. et. al., 2003）。

为什么说，内源性TLR供体比细胞因子更可能对胎牛血清的干扰效应负责呢？因为我们知道细胞因子及其受体的种属特异性是很强的，并且细胞因子的稳定性差，容易失活。而相应的内源性TLR供体——比如HSP60/70、透明质酸上的寡糖、肝素上的多糖——在进化上要保守得多，种属间没有什么差异。所以牛表达的这些TLR供体刺激人或者鼠或者猴子的白细胞上的TLR几乎与种属内的刺激有相同的效果。另外，牛TLR供体的稳定性好得多，不会在血清保存或者灭活补体的过程中失活。

在这近20年的时间里，人们只能采用最繁琐的办法来努力消除血清的干扰。具体做法是从全世界不同的血清供应商那里索取各种不同批次的血清样品，然后逐一做ELISPOT对比实验，找出干扰最小、重复性最好的血清品种与批次。然后就大量购买该品种、该批次的血清，以后每次都用它做检测。直至该批次血清用尽，然后再开始下一轮的比较与采购。为了ELISPOT检测结果的连贯性，通常会保留少许上批次的血清，用以作下轮比较的参照。

血清就是这样困扰着ELISPOT技术将近20年。人们一直渴望有一种化学成分完全限定，对ELISPOT没有任何干扰的，批次间影响完全相同的培养基，以彻底消除血清对ELISPOT技术的干扰，于是就催生了无血清ELISPOT技术。在最近两三年的进步与实践中，无血清ELISPOT技术经历诸多考验，已经成熟。