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细胞分离的基本原理

提供者:上海一研生物科技有限公司   发布时间:2016/12/15 15:20:21  阅读次数:232次  进入该公司店铺

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基本原理:本文分离细胞所用方法是Percoll非连续性密度梯度离心法,主要是根据不同细胞间密度的差别进行细胞分离。此法易操作,且使用通常的实验设备即可完成。
试剂与器材
1)外周血单个核细胞
2)1×PBS和10×PBS(无Ca2+、Mg2+,0.5mM EDTA),胎牛血清(56℃,30分钟加热灭活),HCl1mol/L。
Percoll分层液(密度=1.130g/ml,商品),4g/L台盼蓝染液(溶解在PBS液中)。
3)50ml聚丙烯圆锥管,毛细吸管,移液管(1、2、10ml)。
4)CO2孵箱,超净台,有旋转桶转子装置的离心机,PH计。
操作步骤——所有的操作应该在无菌条件下进行
(一)不同密度Percoll分层液的配制
1.Percoll分层液储备液的制备:取未稀释的Percoll原液(从瓶中取)9ml+1ml 10×PBS(无Ca2+、Mg2+),用HCl 调节PH至7.4
2. Percoll分层液(Ⅰ)(密度=1.080g/ml)的配制:取Percoll储备液3.12 ml(前一步配制)+1.88ml 1× PBS1(无Ca2+、Mg2+)
3. Percoll分层液 (Ⅱ)(密度=1.069g/ml)的配制:取Percoll分层液(Ⅰ)2.68 ml+2.32ml1×PBS( 无Ca2+、Mg2+)
4. Percoll分层液(Ⅲ)(密度=1.060g/ml)的配制:取Percoll分层液(Ⅱ)2.32 ml +2.68 ml1×PBS(无Ca2+、Mg2+)
(二)不连续密度梯度制备
1.将洗涤过的8×107外周血单个核细胞重新悬浮在2ml的Percoll分层液(Ⅰ)(密度=1.080g/ml)在这层液体的表面上轻轻铺上2mlPercoll分层液(Ⅱ)(密=1.069g/ml),后再于第二层液面上轻轻铺上2ml的Percoll分层液(Ⅲ)(密度=1.060g/ml)

2. 20℃,在旋转转子中1000×g离心上步所形成的密度梯度90分钟(慢慢增加速度,无制动停转)。

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