关于ELISA试剂盒双抗体夹心法测抗原是检测抗原最常用的方法

1） 将特异性抗体与固相载体联结，形成固相抗体。洗涤除去未结合的抗体及杂质。

2） 加受检标本，保温反应。标本中的抗原与固相抗体结合，形成固相抗原抗体复合物。

　　洗涤除去其他未结合物质。

3） 加酶标抗体，保温反应。固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。彻底洗涤未结合

　　的酶标抗体。此时固相载体上带有的酶量与标本中受检抗原的量相关。

4） 加底物显色。固相上的酶催化底物成为有色产物。通过比色，测知标本中抗原的量。

　　在临床检验中，此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原，例如HBsAg、HBeAg、

AFP、hCG等。只要获得针对受检抗原的异性抗体，就可用于包被固相载体和制备酶结合

物而建立此法。如抗体的来源为抗血清，包被和酶标用的抗体最好分别取自不同种属的动

物。如应用单克隆抗体，一般选择两个针对抗原上不同决定簇的单抗，分别用于包被固相

载体和制备酶结合物。这种双位点夹心法具有很高的特异性，而且可以将受检标本和酶标

抗体一起保温反应，作一步检测。

　　在一步法测定中，当标本中受检抗原的含量很高时，过量抗原分别和固相抗体及酶标

抗体结合，而不再形成"夹心复合物"。类同于沉淀反应中抗原过剩的后带现象，此时反应

后显色的吸光值（位于抗原过剩带上）与标准曲线（位于抗体过剩带上）某一抗原浓度的

吸光值相同，如按常法测读，所得结果将低于实际的含量，这种现

象被称为钩状效应（hook effect），因为标准曲线到达高峰后呈钩状弯落。钩状效应严重

时，反应甚至可不显色而出现假阴性结果。因此在使用一步法试剂测定标本中含量可异常

增高的物质（例如血清中HBsAg、AFP和尿液hCG等）时，应注意可测范围的最高值。用

高亲和力的单克隆抗体制备此类试剂可削弱钩状效应。

　　假使在被测分子的不同位点上含有多个相同的决定簇，例如HBsAg的a决定簇，也可

用针对此决定的同一单抗分别包被固相和制备酶结合物。但在HBsAg的检测中应注意亚型

问题，HBsAg有adr、adw、ayr、ayw4个亚型，虽然每种亚型均有相同的a决定簇的反应

性，这也是用单抗作夹心法应注意的问题。

双抗体夹心法测抗原的另一注意点是类风湿因子（RF）的干扰。RF是一种自身抗

体，多为IgM型，能和多种动物IgG的Fc段结合。用作双抗体夹心法检测的血清标本中如含

有RF，它可充当抗原成份，同时与固相抗体和酶标抗体结合，表现出假阳性反应。采用

F（ab＇）或Fab片段作酶结合物的试剂，由于去除了Fc段，从而消除RF的干扰。双抗体

夹心法ELISA试剂是否受RF的影响，已被列为这类试剂的一项考核指标（参见6.2）。

　　双抗体夹心法适用于测定二价或二价以上的大分子抗原，但不适用于测定半抗原及小

分子单价抗原，因其不能形成两位点夹心。

双抗原夹心法测抗体

　　反应模式与双抗体夹心法类似。用特异性抗原进行包被和制备酶结合物，以检测相应

的抗体。与间接法测抗体的不同之处为以酶标抗原代替酶标抗抗体。此法中受检标本不需

稀释，可直接用于测定，因此其敏感度相对高于间接法。乙肝标志物中抗HBs的检测常采

用本法。本法关键在于酶标抗原的制备，应根据抗原结构的不同，寻找合适的标记方法。