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单向定量免疫电泳

提供者:上海邦景实业有限公司   发布时间:2016/7/8 13:58:20  阅读次数:177次  进入该公司店铺

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单向定量免疫电泳又称火箭电泳(rocket immunoelectrophoresis)。在琼脂内掺入适量的抗体,在电场作用下,定量的抗原泳动遇到琼脂内的抗体,形成抗原-抗体复合物沉淀下来。走在后面的抗原继续在电场作用下向正极泳动,遇到琼脂内沉淀的抗原-抗体复合物,抗原量的增加造成抗原过量,使复合物沉淀溶解,一同向正极移动而进入新的琼脂内与未结合的抗体结合,又形成新的抗原-抗体复合物沉淀下来,不断地沉淀-溶解-再沉淀,直至全部抗原和抗体结合,在琼脂内形成锥形的沉淀峰,称火箭电泳。火箭峰的长度与标准抗原比较,可计算待测抗原的浓度。
本实验以人血清作为抗原,免疫动物(家兔)产生抗血清,当适量抗原、抗体在琼脂糖中扩散,两者相遇时,则形成抗原抗体复合物的白色沉淀线。不同的抗原分子与相应的抗体分子的扩散速度不同,当两者间比例适当时,出现数目不同的沉淀线,根据沉淀线的出现可以定性抗原、诊断疾病或测定抗体的效价。
试剂和器材
1、试剂
抗原:甲胎球蛋白(1~5mg/mL)。
免疫血清(抗血清):家兔抗人甲胎球蛋白血清。
琼脂糖(或进口分装琼脂粉)。
pH8.6电极缓冲液(巴比妥缓冲液)离子程度0.05u:取巴比妥1.84g,巴比妥钠10.3g溶于蒸馏水,定溶至1L。制备琼脂溶液时需要将上述缓冲稀释1倍,离子强度为0.025u。
2、器材
载玻片、打孔器、微量取液器、稀释板、培养器或带盖培养皿。
操作方法
1、抗体琼脂板的制备
将融化的琼脂冷却到55℃,加入适量(看免疫血清的效价高低而定)的抗体,立即混匀(不要出现泡沫),将上述的抗体琼脂(大约20mL)制成琼脂板,冷却后打孔备用。
2、加样
在各孔里加入不同稀释度的抗原
3、电泳
在平板电泳槽里倒进离子强度u=0.05的巴比妥缓冲液。将凝胶板平放在电泳槽中的隔板上。琼脂的两端用浸温的滤纸做桥与电泳槽的电极缓冲液相链接,抗体端接正极。通电,电流强度按琼脂板的宽度计算(1~2mA/cm)。观察到白色沉淀线时,即电泳完毕(一般1h左右)。一般通电后调电压为10V/cm,或电流强度为2~4mA/cm时间约1~5h。
4、定量抗原
在电泳一定时间后可以观察到火箭状的白色沉淀峰。电泳完毕后可以用肉眼观察量出已知抗原量的各个火箭的高度,画出标准曲线,便可测出未知浓度的抗原量。如果精确计算的话,可用求积仪测定峰的面积。
注意事项
1、影响单向定量免电泳的因素很多,主要是要选择好抗体浓度,使抗原抗体浓度比例合适。这就需要根据免疫血清的效价来定所加入琼脂中的康体量,如效价高,则免疫血清琼脂的比列为1:5~9,如效价低,则免疫血清与琼脂的比列为2:5。
2、加入的抗体量要合适,以保证抗原、抗体的合适比例,以便形成清晰的沉淀峰。抗体的准确用量应通过预实验来决定,即加入不同量的抗血清,用一定量的抗原进行火箭电泳,选出沉淀峰在2~5cm之间的相应抗体浓度就是合适的抗体用量。

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