技术分析之：大鼠内皮祖细胞培养方法
细胞描述

内皮祖细胞是一群异质性的细胞群体，主要起源于骨髓里复杂的前体细胞，并以不同的分化阶段存在于外周循环中。因其是能分化为内皮细胞的前体细胞，因此被命名为内皮祖细胞。1997 年时，Asahara 等首次利用细胞表面标志物 CD34 等通过免疫磁珠的方法从人的外周血中成功分离得到内皮祖细胞，并证明其在体内有形成血管的能力，随后于 1999 年证明来源于骨髓的内皮祖细胞能以血管发生的方式参与出生后的生理与病理性的血管形成。内皮祖细胞的成功发现彻底改变了人们对于血管形成的认识，它能够选择性地归巢到受损或者缺血部位，参与局部的血管发生与血管新生，从而形成血管，同时，还能促进内皮的修复等。近年来，研究显示内皮祖细胞具有十分广阔的应用前景，可用于血管新生、内皮再生、心血管病治疗、肿瘤的治疗、缺血性治疗、组织工程、基因治疗等领域，因此，简单、快速、可靠、足量地获取内皮祖细胞十分必要。

试剂和材料

成年大鼠

血清

Ficoll

M199 基础培养基

实验步骤

1、大鼠腹腔注射 0.5 ml 3% 的 C11H17O3N2Na 麻醉致死，浸入盛有体积分数 75% 乙醇的烧怀中消毒 15 min 后移出。

2、无菌条件下取出股骨、胫骨，去除干净附着于骨表面的肌肉。

3、将获取的骨头浸入盛有磷酸盐缓冲液 PBS 的小烧怀中，用剪刀剪去骨头两端的干骺端，暴露出骨髓腔。

4、取一支 10 ml 一次性注射器抽取 6~8 ml 的 M199 基础培养基冲洗骨髓腔数次，至骨头发白透亮，收集细胞悬液。

5、取大鼠淋巴细胞分离液 4 ml 加入 12 ml 的离心管中，倾斜 45 度，再缓缓将细胞悬液加于淋巴细胞分离液之上，使其体积比为 1:2,注意保持两者之间的界面清晰，勿使其彼此混合。

6、将离心管配平后放于离心机中，离心半径 12 cm,2000r/min，离心 20 min。

7、缓缓取出离心管，可看到离心管内的液体分为 4 层，最下层为红细胞与粒细胞，中间层为淋巴细胞分离液，最上层为血浆与 M199 培养基，在中间层与最上层之间有一层薄薄的云雾状层。

8、以移液器直插入云雾状层，缓缓抽吸；

9、将抽取的液体转移入另一离心管中，然后加入 10 ml PBS 缓冲液，吹打均匀，离心，离心半径 12 cm,1500r/min，离心 5 min;10、吸弃上清液，取 10 ml PBS 缓冲液，吹打均匀，离心，离心半径 12 cm，1500r/min，离心 5 min。

11、吸弃上清液，加入 5 ml M199 完全培养基，将细胞沉淀吹打均匀，接种于 T25 细胞培养瓶中，放入 CO2 培养箱培养。

细胞传代及冻存

1、细胞生长至对数期，细胞达到 80-90% 融合。

2、移除细胞培养基，PBS 清洗细胞 2 次。

3、加入 0.25% 胰酶，37℃ 消化，镜下观察细胞回缩变圆，完全培养基终止消化。

4、离心，重悬细胞后重新接种于新鲜培养基中。

5、细胞不可冻存。
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