HRP在蔬菜作物辣根中含量很高，纯化方法也不复杂。它是一种糖蛋白，含糖量约18％；分子量为44kD；是一种复合酶，由主酶（酶蛋白）和辅基（亚铁血红素）结合而成的一种卟啉蛋白质。主酶为无色糖蛋白，在275nm波长处有最高吸收峰；辅基是深棕色的含铁卟啉环，在403nm波长处有最高吸收峰。HRP催化下列反应。

上式中DH2为供氢体，H2O2O为受氢体。HRP对受氢体的专一性很高，除H2O2外，仅作用于小分子醇的过氧化物和尿素的过氧化物。后者为固体，作为试剂较H2O2方便。许多化合物可作为HRP的供氧体，在酶联免疫吸附剂测定中常用的供氢体底物为邻苯二胺（orthopenylenediamine，OPD）、四甲基联苯胺（3，3＇，5，5＇-tetramethylbenzidine，TMB）和ABTS[2，2＇-azino-bis（3-ethyl-benzthiazolinesulfonate-6）]。

OPD为在酶联免疫吸附剂测定中应用最多的底物，灵敏度高，比色方便。其缺点是配成应用液后稳定性差，而且具有致异变性。TMB无此缺点。TMB经酶作用后由无色变蓝色，目测对比鲜明；加酸停止酶反应后变黄色，可在比色计中定量；因此应用日见增多。ABTS，虽然灵敏度不如OPD和TMB，但空白值很低。HRP催化OPD的反应如下：HRP的纯度用RZ（ReinheitZahl，意为纯度数）表示，是403nm的吸光度与280nm的吸光度之比，高纯度的HRP的RZ≥3.0。应注意的是酶变性后，RZ可不变而活力降低，故重用酶制剂时更重要的指标为活力。酶活力以单位表示：1min将1μmol的底物转化为产物的酶量为1个单位。

在酶联免疫吸附剂测定中另一常用的酶为碱性磷酸酶。从大肠杆菌提取的AP分子量为80kD，酶作用的最适pH为8.0；用小牛肠粘膜提取的AP分子量为100kD，最适pH为9.6。一般采用对硝基苯磷酸酯（p-nitrophenylphosphate，p-NPP）作为底物。它可制成片状试剂，使用方便。产物为黄色的对硝基酚，在405nm有吸收峰。用NaOH终止酶反应后，黄色可稳定一段时间。

在酶联免疫吸附剂测定中应用AP系统，其敏感性一般高于应用HRP系统，空白值也较低。但由于AP较难得到高纯度制剂，稳定性较HRP低，价格较HRP高，制备酶结合物时得率较HRP低等原因，国内在酶联免疫吸附剂测定中一般均采用HRP。

除HRP和AP以外，在商品酶联免疫吸附剂测定试剂中应用的酶尚有葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶和脲酶等。β-半乳糖苷酸的底物常用4-甲基伞基-β-D半乳糖苷（4-mehtyumbelliferyl-β-D-galactoside），经酶水解后产生荧光物质4-甲基伞酮（4-mehtylumbelliferone），可用荧光计检测。荧光的放大作用大大提高了方法的敏感度。AP也可应用可产生荧光的伞基磷酸酯作底物。其缺点是需要荧光计测定，而且如用固相载体直接作为测定容器，此载体不可发出荧光。脲酶的特点是酶作用后反应液发生pH改变，可使指示剂变色；另外，在人体内没有内源酶。
欢迎您点击公司网站“在线客服”查询最新价格与优惠信息。