荧光标记原位杂交法(fluorescence in situ hykbridizatlon，FISH)是近年发展起来的非放射性标记新技术。FISH可检测单拷贝基因、表达mR>JA等；其有无毒性、快速、分辨率高等优点，获得广泛的应用。

(一)原理

荧光标记原位杂交是利用基因探针在组织切片、细胞或染色体上进行分子杂交的方法。先把17NA探针借缺口翻译标记在适当半抗原如生物素dUTP上，与染色体或组织切片标本杂交。然后使dUTP与抗体／荧光素复合体进行反应和结合，便可在镜下显现荧光并被观察到。FISH法已广泛应用到染色体基因定位、细胞中RNA或病毒DNA的检测。FISH其有操作方便，敏感、简便、安全、实用，特别是可用多种显色，对确定染色体基因结构的分析是十分有用的手段。由于可在组织切片或细胞上检测基因的拷贝数或基凶的表达状况，因此这一技术在临床疾病诊断方面有好的应用前景。

(二)方法

原位杂交的主要技术：细胞准备、组织标本制备、探针标记、杂交和洗片、探针杂交信号的显示等几步组成，分述如下：

1．标本制备

(1)按常规方法制备染色体滴片标本，室温下干燥后置真空干燥容器内储存。使用时先在56℃干烤过夜；

(2)培养细胞标本制作与染色体方法相同(亦可用按常规法制备的组织病理切片标本)：

2．探针标记

用生物素标记DNA探针：按Oncor缺口翻译试剂盒操作，取：

DNA(μg／μl) 1．0μl

核酸缓冲液(10×) 10．Oμl

DNA聚合酶 5．Oμl

双蒸水 34μl

混匀后置15℃水浴中，温浴2．5h，然后加终止反应液(10mmol／L EDTA，0．1％SDS)lOμl，置冰上。

3．探针的纯化

(1)取1 ml一次性塑料注射器，用少许玻璃棉堵住注射器的下口，用尖吸管将Sepha—dex G一50装入注射器(避免产生气泡)，即成为纯化探针的柱子。取一个15ml离心管，将1．5ml小离心管去盖后放人到15m1离心管底部，并将制备好的柱子放人到离心管内。

(2)将制备好的柱子连同15m1离心管放人离心机中，在室温25℃，1000r／min离心5min。

(3)另取一15ml离心管，在底部放入一个新的1．5ml离心管(去盖)，将制备好的柱子放人离心管中。

(4)将标记好的反应物50μl加入到柱子上端，室温下(25℃)1500r／mm离心5min，再加30μl双蒸水按上述条件离心。

(5)离心后，把收集到的溶液进行定量并将总体积调至100μl，避光放在一20℃保存，一般可存放6个月。

4．杂交和洗片

(1)用RNase处理玻片：将铺有染色体或细胞的玻片放入含有100μg／μl RNase-的溶液中处理60min(37℃)，然后用2×SSC室温洗4遍，每遍2min。用70％、80％、95％冷乙醇在一20℃中进行脱水，每次2min，室温下干燥；

(2)标本变性：将脱水后的玻片放入变性液(4ml 20×SSC、8ml双蒸水、28ml甲酞胺)，在70℃中变性2min。

(3)快速转移到冷的70％乙醇中，作用2min，然后用乙醇依次脱水(80％、95％、100％)，在20℃中进行，每次2min，室温下空气干燥。

5．杂交

(1)加入杂交液前，把玻片放在一个小盒内，盒的下层最好有少许水，以保持玻片有一定湿度，在37℃恒温30min。

(2)探针变性，取1．5μl生物素标记的DNA探针(10ng／μl)加入到30μl闪杂交液中(5×SSC，50％甲酞胺)混匀后放入70℃水浴变性5min，然后迅速放人冰上冷却后加到玻片上(每张玻片30μl)，用盖玻片盖好，放人培养小盒，置37℃培养4～16h。

6．洗片杂交后玻片，小心去除盖玻片，放入清洗溶液中(4ml 20×SSC，16m1双蒸水．20ml甲酞胺)在43℃中洗20min。然后用20×SSC，37℃洗2遍。放入1×PBD溶液中(玻片在4℃可保存2周)。

7．杂交信号显示和放大

(1)将玻片从1×PBD溶液中取出。平放在玻片架上，加60μl封闭液l用石蜡膜盖好，室温下作用5min。

(2)去掉石蜡膜，加60μl荧光标记Avidin溶液，37℃作用20min。

(3)在1xPBD溶液中洗片3次，每遍2min。

(4)杂交信号放大：在玻片上加60μl封闭液2，室温下作用5min，加抗Avidin的抗体．37℃作用20min。

(5)用lx PBD洗片3遍，每遍2min(室温)，加终止液1．60μl，室温下作用5min，加荧光标记Avidin，37℃作用20min，用1×PFD洗3遍。

(6)染色体显色，在玻片上加18μl Propidium Ivdine加antirade，室温下反应5min，加盖玻片，在荧光显微镜下观察。

(三)注意事项

FISH实验中最常见的问题是杂交后没有信号或本底过高。杂交没有信号，往往是由于振针本身或标记不好所致，本底过高的解决办法除改善杂交条件外，洗片时可增加强度，如增加温度或降低盐浓度。实验中的器皿要保持清洁，并尽可能高压灭菌。所用溶液要新配制。细胞