实验材料

烟草细胞：BY-2

实验步骤

1. BY-2 细胞培养

BY -2 细胞悬浮培养在摇床上，避光，温度260 C，转速130r pm，每7天将 1m l 细胞转入20m l新鲜的液体培养基中继续培养。BY -2 愈伤组织生长在固体培养基上，每3-4周继代一次。转基因的悬浮细胞和愈伤组织生长在含相应抗生素的培养基中。

2. 用干转化的农杆菌GV3101的准备

(1)接种农杆菌单菌落到2 ml新鲜的YEB液体培养基中，28“培养过夜;

(2)取200ul培养物加到l0ml新的培养基中继续培养3-4小时:

(3) ＇5000 rpm,离心5 min集菌，用BY-2液体培养基重悬菌体，OD为0.5左右，待用。

3. 农杆蔺介导的BY-2悬浮细胞的外源基因转化

(1)取生长到第3或4天的BY-2细胞4 ml，加入上述备用的农杆菌液100ul，共培养 3天;

(2) 500 g离心2 min，收获细胞并用BY-2液体培养基(Amp 500 mg/L)洗3次 :

(3)将细胞稀释后铺于BY-2固体培养基的平板(Kan 100 mg/L, Amp 500mg /L )上，26℃黑暗培养。

(4)四周后，取出生长良好的愈伤小块，打散后放入液体培养基悬浮培养。

4. 农杆菌介导的BY-2愈伤组织的外源基因转化

(1)取培养2-3周的烟草愈伤组织小块浸入农杆菌液中20 min，取出用无菌滤纸吸干，置BY-2 培养基平板(无抗生素)上培养2天;

(2)取出愈伤小块，用无菌水洗4次，然后用含抗生素(Amp 500 mg/L)的无菌水浸泡30-60m in;

(3)取出愈伤小块，用无菌滤纸吸干，置于培养BY-2的平板(Amp500mg/L，Kan100mg/)上。

(4)培养四周后，挑出生长的愈伤小块，转移到新的抗性平板(Kan 100 mg/L)

上继续生长;

(5)取出生长良好的愈伤小块，打散后放入液体培养基中，26＇C, 130 rpm,在摇床上黑暗培养;