背景染色较深的原因有哪些？

1.抗体浓度过高：一抗浓度过高是常见的原因之一。解决办法是，每次使用新抗体前应当对其工作浓度进行测试，使每一抗体个体化，找到适合自己实验室的理想工作浓度，既使是即用型的抗体也应如此，不能只简单的按说明书进行染色。

2.抗体孵育时间过长或温度较高：解决办法是，严格执行操作规程，最好随身佩带报时表或报时钟，及时提醒，避免因遗忘而造成时间延长。现在流行的二步法（Polymer）敏感性很高，要求一抗孵育的时间不是传统的 1 h，而是 30 min，因此，要根据染色结果进行调整。

3.DAB 变质和显色时间太长：DAB 最好现用现配，如有沉渣应进行过滤后再用。配制好的 DAB 不应存放时间太长，因为在没有酶的情况下，过氧化氢也会游离出氧原子与 DAB 产生反应而降低 DAB 的效力，未用完的 DAB 存放在冰箱里几天后再用这种似乎节约的办法是不可取的。DAB 的显色最好在显微镜下监控，达到理想的染色程度时立即终止反应。不过当染色片太多时或用染色机时，这样做似乎不现实，但至少应对一些新的或少用的抗体显色时进行监控，避免显色时间过长。

4.组织变干：修复液溢出后未及时补充液体、染色切片太多、动作太慢、忘记滴液、滴液流失等都是造成组织变干的原因。解决的办法是操作要认真仔细，采用 DAKO 笔或 PAP Pen 在组织周围画圈，可以有效的避免液体流失，也能提高操作速度。

5.切片在缓冲液或修复液中浸泡时间太长（大于 24 h）：原因上不清楚，但现象存在。有的实验室喜欢前一天将切片脱蜡至修复，第二天加抗体进行免疫组化染色，如果将装有切片和修复液的容器放在 4ºC 冰箱过夜，对结果无明显影响，如果放在室温，特别是炎热的夏天，会出现背景着色，因此，不可存放时间太长。

6.一抗变质、质量差的多克隆抗体：注意抗体的有效期，过期的抗体要么不显色要么背景着色。用新买的抗体时最好设立阳性对照和用使用过的抗体作比较。