快速牛乳孕酮酶联免疫测定基于自由孕酮和辣根过氧化物酶标记孕酮竞争与吸附在微滴反应板孔壁上的孕酮抗体结合，反应时间为2小时，ABTS底物溶液反应1小时，加反应终止液后测410nm吸收值。当特异性抗体量一定时，且小于被测和标记抗原时，未标记抗原浓度越高，标记抗原和抗体的结合就越受到按捺，显色愈浅。敏捷度为5.2pg/孔，批内变异系数为9.06％，批间变异系数为12.9％。结合在免疫复合物上的酶，在碰到相应酶底物时，经催化水解及氧化还原等反应，形成有色产物。

通过对乳汁中孕酮含量的测定，了解酶联免疫吸附分析法的基本原理与检测技术。显色的深浅与酶量呈正相关，而与样品中抗原含量呈负相关。与RIA法相似，利用被测抗原与酶标记抗原对特异性抗体进行竞争结合，测试（加入的）标记在抗原上的酶催化底物所产生的颜色反应。这些酶标记（复合）物仍保持其免疫性和酶活性，再与相应的抗体或抗原发生反应，形成酶标记的免疫复合物。酶联免疫吸附分析法（ELISA试剂盒）是通过化学的方法将酶与抗原或抗体结合，形成酶标记物（或通过免疫学方法将酶与抗酶抗体结合，形成免疫复合物）。

制作酶标孕酮稀释曲线及选择酶标孕酮工作浓度以初选的抗血清稀释度包被酶标板，将酶标孕酮稀释成不同浓度，绘出酶标孕酮稀释曲线，选择斜率最大并有一定光密度值的稀释度为工作浓度。酶标板的预处理新制的酶标板含有有机成分，使用前先用无水乙醇浸泡二小时以上，再用蒸馏水冲刷干净，37℃烘干或阴干。制作孕酮抗血清稀释度曲线及选择孕酮抗血清工作浓度将孕酮抗血清稀释成不同浓度，包被统一酶标板的不同孔眼后，测其光密度，其目的选择最适抗血清稀释工作浓度。跟着抗血清浓度的下降，光密度也随之下降，一般初选光密度值为1.0左右时的稀释度为孕酮抗血清的工作浓度。制作酶标孕酮稀释曲线及选择酶标孕酮工作浓度以初选的抗血清稀释度包被酶标板，将酶标孕酮稀释成不同浓度，绘出酶标孕酮稀释曲线，选择斜率最大并有一定光密度值的稀释度为工作浓度。