1.间接ELISA(酶联免疫吸附试验,酶联免疫试剂盒) 本法主要用于检测抗体。以鸭病毒性肝炎（DVH）抗体的ELISA(酶联免疫吸附试验,酶联免疫试剂盒)为例，间接ELISA(酶联免疫吸附试验,酶联免疫试剂盒)的操作程序如下。

(1) 材料

① 包被液、洗涤液、保温液、底物液、终止液；

② DVH包被抗原、酶标抗抗体、阴性及阳性DVH参考血清；待检鸭血清；

③ ELISA(酶联免疫吸附试验,酶联免疫试剂盒)检测仪、加样器、聚苯乙烯微量板。

(2) 方法步骤

① 加抗原包被 → 4℃过夜，洗涤三次、抛干

② 加待检血清 → 37℃ 2小时，洗涤三次、抛干

③ 加酶标抗体 → 37℃ 2小时，洗涤三次、抛干

④ 加底物液 → 37℃ 30分钟，加终止液

⑤ 用ELISA(酶联免疫吸附试验,酶联免疫试剂盒)检测仪测定OD值，并计算出P/N比值。

(3) 结果判定 已知阳性血清与已知阴性血清的比值（P/N）≥2.1，而且已知阳性血清的OD值≥0.4；在上述条件成立的情况下，如果待检血清与已知阴性血清的比值（P/N）≥2.1，而且待检血清的OD值≥0.4，则判为阳性，否则判为阴性。

2.双抗体夹心ELISA(酶联免疫吸附试验,酶联免疫试剂盒) 本法主要用于检测大分子抗原。现以检测鸡传染性法氏囊病病毒（IBDV）的双夹心抗体ELISA(酶联免疫吸附试验,酶联免疫试剂盒)为例介绍本法的操作程序。

① 加抗体包被 → 4℃过夜，洗涤三次、抛干

② 加待检抗原 → 37℃ 30分钟，洗涤三次、抛干

③ 加酶标抗体 → 37℃ 30分钟，洗涤三次、抛干

④ 加底物液 → 37℃ 15分钟，加终止液

⑤ 用ELISA(酶联免疫吸附试验,酶联免疫试剂盒)检测仪测定OD值。

3.双夹心ELISA(酶联免疫吸附试验,酶联免疫试剂盒) 此法与双抗体夹心ELISA(酶联免疫吸附试验,酶联免疫试剂盒)的主要区别在于：它是采用酶标抗抗体检查多种大分子抗原，它不仅不必标记每一种抗体，还可提高试验的敏感性。此法的基本程序为：

① 加抗体（Ab-1）包被 → 4℃过夜，洗涤三次、抛干

② 加待检抗原（Ag） → 37℃ 60分钟，洗涤三次、抛干

③ 加用非同种动物生产的特异性抗体（Ab-2）→ 37℃ 60分钟，洗涤三次、抛干

④ 加入酶标抗Ab-2抗体（AB-3）→ 37℃ 60分钟，洗涤三次、抛干

⑤ 加底物液 → 37℃ 20分钟，加终止液

⑥ 用ELISA(酶联免疫吸附试验,酶联免疫试剂盒)检测仪测定OD值。

4.竞争ELISA(酶联免疫吸附试验,酶联免疫试剂盒) 此法主要用于测定小分子抗原及半抗原，其原理类似于放射免疫测定。其基本程序为：

① 抗体包被 → 4℃过夜，洗涤三次、抛干

② 加入待检抗原及一定量的酶标抗原（对照孔仅加酶标抗原）→ 37℃ 60分钟，洗涤三次、抛干

③ 加底物液 → 37℃ 20分钟，加终止液

④ 用ELISA(酶联免疫吸附试验,酶联免疫试剂盒)检测仪测定OD值。

被结合的酶标抗原的量由酶催化底物反应产生有色产物的量来确定，如果待检溶液中抗原越多，被结合的标记抗原的量就越少，有色产物就减少，这样根据有色产物的变化就可求出未知抗原的量。此法的优点在于快速、特异性高、且可用于小分子抗原及半抗原的检测；其主要不足在于每种抗原都要进行酶标记，而且因为抗原的结构不同，还需应用不同的结合方法。此外，试验中应用酶标抗原的量较多。5.阻断ELISA(酶联免疫吸附试验,酶联免疫试剂盒) 本法主要用于检测型特异性抗体。该方法现已成为猪传染性胃肠炎（TGE）、猪伪狂犬病（PR）及猪胸膜肺炎（AP）的主要检测方法。下面以AP2型抗体的阻断ELISA(酶联免疫吸附试验,酶联免疫试剂盒)检测法为例介绍其操作程序：

① 100μl AP2型工作量抗原包被 → 4℃过夜，洗涤三次、抛干

② 用200μl阻断缓冲液进行封闭 → 37℃ 60分钟，洗涤三次、抛干

③ 加工作量1:4稀释被检猪血清100μl → 37℃ 60分钟，洗涤三次、抛干

④ 加100μl工作量兔抗AP2型血清 → 37℃ 30分钟，洗涤三次、抛干

⑤ 加100μl工作量猪抗兔IgG-HRP → 37℃ 60分钟，洗涤三次、抛干

⑥ 加100μl OPD底物液 → 37℃ 20分钟，加终止液

⑦ 用ELISA(酶联免疫吸附试验,酶联免疫试剂盒)检测仪测定OD值。

本试验同时设标准阴、阳性血清对照、兔抗AP2型阳性对照、空白对照。

6.抗体捕捉ELISA(酶联免疫吸附试验,酶联免疫试剂盒) 本法主要用于检测IgM抗体。由于IgM抗体出现于感染早期，所以检测出IgM，则可作为某种疾病的早期诊断。抗体捕捉ELISA(酶联免疫吸附试验,酶联免疫试剂盒)根据所用标记方式不同可分为标记抗原、标记抗体、标记抗抗体捕捉ELISA(酶联免疫吸附试验,酶联免疫试剂盒)等几种，其中以标记抗原捕捉ELISA(酶联免疫吸附试验,酶联免疫试剂盒)比较有代表性，该方法的主要程序为：

① 用抗u链（抗IgM重链）抗体包被→37℃ 60分钟后置4℃过夜，洗涤三次、抛干

② 加待检血清 → 37℃ 2小时，洗涤三次、抛干

③ 加酶标抗原 → 37℃ 60分钟，洗涤三次、抛干

④ 加底物液 → 37℃ 20分钟，加终止液

⑤ 用ELISA(酶联免疫吸附试验,酶联免疫试剂盒)检测仪测定OD值。

7.斑点ELISA(酶联免疫吸附试验,酶联免疫试剂盒)（Dot-ELISA(酶联免疫吸附试验,酶联免疫试剂盒)） 与常规的微量板ELISA(酶联免疫吸附试验,酶联免疫试剂盒)比较，Dot-ELISA(酶联免疫吸附试验,酶联免疫试剂盒)具有简便、节省抗原等优点，而且结果可长期保存；但其也有不足，主要是在结果判定上比较主观，特异性不够高等。该方法的主要操作程序为：(1)载体膜的预处理及抗原包被 取硝酸纤维素膜用蒸馏水浸泡后，稍加干燥进行压圈。将阴性、阳性抗原及被检测抗原适度稀释后加入圈中，置37℃使硝酸纤维素膜彻底干燥。每张7cm×2.3cm的膜一般可点加40－53个样品，每个压圈可加抗原液1－20μl。

(2) 封闭 将硝酸纤维素膜置于封闭液中，37℃感作15－30分钟。封闭液多采用含有正常动物血清、pH7.2或pH7.4的PBS。

(3) 加被检血清 可直接在抗原圈上加，也可剪下抗原圈、置于微量板孔中，再加入一定量适度稀释的待检血清，37℃反应一定时间，用洗涤液洗三次，每次1－3分钟。洗涤液一般为一定浓度的PBS-Tween溶液。

(4) 加酶标抗体，37℃反应一定时间后，用洗涤液洗三次。

(5)显色加入新鲜配制的底物液，37℃反应一定时间后，去掉底物液，加蒸馏水洗涤终止反应。

(6) 结果判定 以阳性、阴险血清作为对照，膜片中央出现深棕红色斑点者为阳性反应，否则为阴性反应。