普通RT-PCR检测

普通RT-PCR反应体系

一步法普通RT-PCR 反应体系见表3。每个反应体系设置两个平行反应。反应体系中各试剂的量可根据具体情况或不同的反应总体积进行适当调整。也可采用RT-PCR 两步法试剂盒。

以诺如病毒RNA 为阳性对照，以不含有诺如病毒的样品RNA 作为阴性对照，以水代替模板作为空白对照。

普通RT-PCR反应条件

反应条件为：42 ℃ 60 min；94 ℃ 10 min；94℃ 1 min，37 ℃ 90 s，72 ℃1 min，40 个循环；74 ℃ 7 min。

PCR扩增产物的电泳检测用电泳缓冲液（1×TAE）、0.5μg/mL 溴化乙锭（或GoldView）配1.5%的琼脂糖凝胶。在电泳槽中加入电泳缓冲液，使液面刚刚没过凝胶。将9 μL PCR 扩增产物，加1μL 10×上样缓冲液，点样，电泳。电

压根据电泳槽长度来确定，一般控制在3 V/cm～5V/cm，当溴酚蓝移动到凝胶边缘时关闭电源。凝胶成像系统观察电泳结果，获取并保存图像。

实时荧光RT-PCR

实时荧光RT-PCR反应体系

一步法普通RT-PCR 反应体系见表4。反应体系中各试剂的量可根据具体情况或不同的反应总体积进行适当调整。可采用商品化的RT-PCR 试剂盒。

以诺如病毒RNA 为阳性对照，以不含有诺如病毒的样品RNA 作为阴性对照，以水代替模板作为空白对照。

替模板作为空白对照。

实时荧光RT-PCR反应条件

反应条件为：48℃ 45min；50℃ 2min；95℃ 10min；95℃ 15 s，56℃ 1 min，45 个循环。

注：不同仪器可根据仪器要求将反应参数作适当调整。