1. 一周龄Wistar大鼠，断颈处死，于75%乙醇浸泡15 分钟，无菌取出胰腺，于冰冷无菌D-Hanks’液中漂洗，用眼科剪仔细清除脂肪、包膜、血管等胰外组织，转入青霉素小瓶中。

2. 加入少量无菌D-Hanks’液，用眼科剪剪成0.1-1.0 mm³ 大小的碎片，用滴管轻轻吸出上层细小脂肪碎块和油滴，再用无菌D-Hanks’液反复清洗 8~10 次，加入10 倍体积无菌消化酶液[胰蛋白酶-胶原酶消化液：0.05 g 胰蛋白酶，0.025 g Ⅴ型胶原酶（663 U/mg），0.05 g 葡萄糖，溶于100mL 无Ca²⁺、Mg²⁺的0.01 mol/L PBS（pH 值为 7.4）溶液，用0.22 µm 微孔滤膜滤菌]，38℃±1℃消化，消化过程中不断震荡，10 分钟后弃去上清液。

3. 用无菌D-Hanks’液将组织块清洗 2~3 次，加入新鲜酶液继续消化，重复上述步骤，此时组织块边缘模糊。

4. 将组织块浸入消化酶液中，38℃±1℃消化10 分钟，将消化酶液与组织块分开，组织块重新加入新鲜消化酶液进行消化；而原消化酶液1500 rpm离心 10 分钟，取沉淀即为消化下的细胞，重新用无菌D-Hanks’悬浮，离心，重复 1~2 次，再用培养基洗 2~3 次，用培养基悬浮即得细胞悬液。

5. 将消化过的组织块重复消化5~6 次至组织块消化完全，重复以上操作。

6. 合并几次所得细胞悬液，计数，调整细胞浓度为 2×10⁵个细胞/mL，将细胞悬液接种于24 孔塑料培养板中，每孔1 mL，置于37℃，5%CO₂，饱和湿度培养箱中培养。

7. 由于成纤维细胞贴壁要比胰岛细胞迅速，接种15 h 后，轻轻振荡培养板，将上面未贴壁的细胞接入新的培养板中，可除去部分成纤维细胞。

8. 将新培养板中细胞培养 48 小时后，换新鲜配置的含有2.5 ng/mL 的碘乙酸的培养基培养5 h，可除去绝大部分成纤维细胞，而胰岛细胞不受伤害，换不含碘乙酸的培养基洗2 次，并换不含碘乙酸的培养基在 37℃、5% CO₂，饱和湿度培养箱中培养，每隔 3 天换培养液，获得单层胰岛细胞。