一、材料准备

1. 包被液：0.05 mol/l（pH9.6）碳酸盐缓冲液：Na₂CO₃ 0.159 g，NaHCO₃ 0.294 g，用蒸馏水溶解后，定容至100 ml。

2. PBS-T洗涤液：0.01mol/ pH7.4磷酸盐-氯化钠缓冲液：NaCl 8.0 g，KH₂PO₄ 0.2 g，Na₂HPO₄·12H₂O 2.9 g，KCl 0.2 g，吐温-20 0.5 ml，用蒸馏水溶解后，定容至1000 ml。

3. 底物溶液3，3’，5,5‘-四甲基联苯胺（TMB）贮存液及应用液：

（1）0.1 mol/l pH6.8 PBS：Na₂HPO₄·12H₂O 1.09 g，NaH₂PO₄·H₂O 6.05 g，蒸馏水溶解后定容至500 ml，4℃保存备用。

（2）TMB贮备液：TMB 60 mg 溶于10 ml 二甲基亚砜（DMSO）中4℃保存备用。

（3）TMB应用液：临用前取0.1 mol/l pH6.0 PBS 10 ml，TMB贮备液100 ul，30%H₂O₂ 15 ul 混匀即可。

二、实验步骤

1. 抗体包被

（1）抗体用包被液稀释至20 ug/ml，加入聚苯乙烯反应板中每孔100 ul，加盖后放4℃过夜。

（2）倾去孔内液体，加入洗涤液后静置3 min，倾尽洗涤液，重复洗涤3次。

（3）将反应板口在吸水纸上，以除尽液体。

2. 封闭：每孔加入200 ul封闭液，37℃孵育60 min，然后洗涤3次。

3. 加入待测血清，37℃温育1~2 h，洗涤3次。用稀释液作对照孔，标准曲线的制备是用不容稀释度的纯GST-π。

4. 加酶标抗体：按要求稀释抗GST-π-IgG-HRP，每孔100 ul，37℃温育1 h，然后洗涤5次，扣在吸水纸上吸干水分。

5. 显色：加入TMB应用液，置室温反应15~30 min，加入50 ul 2 mol/l H₂SO₄，稳定3~5 min，即可比色。

6. 比色：用酶标仪，以PBS-T孔为对照，波长450 nm，测各孔光吸收度（A），查标准曲线，即可测得GST-π含量。