梯度PCR梯度设置技巧（退火温度的探索）
相信在PCR时大家遇到最为关键的问题就是关于退火温度的探索。下面我们就来谈谈这方面的内容。 1. 公式计算
退火温度＝Tm－（5℃～8℃）；Tm＝4×（G＋C）＋2×（A＋T）。首先用公式计算出引物Tm值，退火温度粗略的比引物的Tm低5℃左右，此法所得结果较为粗略
2. 软件计算
将设计的引物和PCR产物放到Oligo 6 或CAN.cn/category.php?id=7">Primer5中去评价，软件分析得出最佳的退火温度和循环参数。此法所得结果较为接近实际退火温度。
下面我们以12x8的96孔梯度PCR仪来为例说明。首先设定温度梯度，例如设定初始温度为58℃，温度梯度是12，那么每一排的温度差就是12/12（可设12个温度梯度的梯度PCR仪，每一排即每8个孔温度相同）。然后，PCR结束后点样观测哪个温度的样品条带最好，进而确定该引物的退火温度。 用梯度PCR仪寻找最佳PCR退火温度方便简单，能够减少寻找最佳退火时所需PCR循环的次数和时间。
一般情况下合理的退火温度约是从55℃到70℃。退火温度的设定一般要比引物的Tm低5℃。实验过程中设置退火温度时应比引物产品说明书标明的退火温度高出1℃~2℃最佳。
以上就是常见关于退火温度的探索，仅供参考。实际操作中只要大家多多操作，认真探索，解决这个问题并不困难。
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