磺胺二十合一酶联免疫分析（ELISA）试剂盒注意事项
1.1 使用试剂盒前请仔细阅读说明书。
1.2 不要使用过期试剂盒。
1.3 试剂盒使用前，将试剂恢复至室温（25±2℃），建议至少回温2小时。
1.4 标准品中含有磺胺二十合一，使用时应特别注意，操作时应带手套。
1.5 终止液中含有硫酸，使用时防止灼伤皮肤及腐蚀衣物。
1.6 不同标准品、样品所用吸头不能混用，否则会影响试验结果。
1.7 不同批号试剂盒中的试剂不得混用；不同标准品、样品所用吸头不得混用，否则会影响
实验结果。
1.8 稀释样本时必须用本试剂盒中的样本稀释液，否则会影响实验结果
1.9 混合试剂时应避免起泡。
2 工作液准备
2.1 磺胺二十合一标准品溶液：0ppb,0.1ppb,0.3 ppb,0.9ppb,2.7 ppb,8.1ppb
2.2 浓缩洗涤液：用蒸馏水按1:20（1+19）稀释备用
2.3 样本稀释液：用蒸馏水按1:10（1+9）稀释备用
2.3 显色剂：已备用，避免光线直照
2.4 反应终止液：已备用
3 样品处理程序（样品在提取过程中，要严格按说明书操作，提取过程中应准确稀释，否则
会出现结果不准确，样品应当保存在阴凉避光之处及冷藏保存）
3.1取10g粉碎的样品，加 20ml 70%甲醇溶液
3.2强力振荡3分钟
3.3用Whatman No 1滤纸过滤
3.4取25μl处理后的样品，加入25μl样本稀释液于反应孔中（样本稀释倍数为2）
4 酶免分析步骤
4.1 实验须知
4.1.1 实验开始前请将所有试剂于盒外充分恢复至室温（252℃），时间约2小时。回温至室
温（252℃）后再取出微孔条，多余的微孔条重新密封立即于2~8℃干燥保存
注：一定保证回温充分，否则影响检测的精确度和准确度。
4.1.2 使用后请立即将试剂放回2~8℃保存
4.1.3 请不要改变分析程序
4.1.4 请使用精确的微量移液器
4.1.5 操作一旦开始，请不要中断任何程序
4.1.6 ELISA结果的可重复性极大程度的取决于操作程序，请严格按照要求操作
4.1.7 为避免交叉污染，每个标准品和样品均应使用不同的吸头加样
4.1.8 加样时请勿让吸头接触微孔中的溶液或内表面
4.2 分析步骤
4.2.1 预先进行编号，标记B0、标准品和样品的位置，推荐进行双孔检测
4.2.2 取所需数量的微孔（微孔条可拆），将多余板条重新密封并立即放回2~8℃保存
4.2.3 样品稀释液（10）、浓缩洗涤液（20）稀释成工作液（蒸馏水或去离子水稀释）
4.2.4 在B0孔中加入50μl0.0 ng/ ml标准品溶液
4.2.5 在各标准孔中加入50μl的标准品溶液
4.2.6 在各样品孔中加入50μl样品溶液
4.2.7 在所有孔中加入50μl的抗磺胺二十合一抗体酶结合物
4.2.8 轻轻晃动反应板几秒钟。
4.3 37℃温浴30min （温浴过程中不时轻拍反应板，可以减少双孔误差）
4.3.1 甩掉孔中液体，用洗液洗涤微孔板5次，最后一次应在吸水纸上拍打以完全除去孔中液体。
4.4 反应
4.4.1 洗涤程序完成后，立即用微量移液器在每个微孔中先加入50μl显色液A，再加 50μl显
色液B；轻微晃动反应板使之彻底混匀
4.4.2 37℃温浴10min
4.4.3 每孔中加入50μl终止液，混匀
4.4.4 在450nm下检测吸光度，结果在5min内读取。
5 结果计算
5.1定量分析
5.1.1所获得的每个浓度标准溶液和样本吸光度值的平均值（B）除以第一个标准（0标准）
的吸光度值（B0）再乘以100%，即百分吸光度值。
B—标准溶液或样本溶液的平均吸光度值
B0—0μg/L标准溶液的平均吸光度值
5.1.2以磺胺二十合一浓度的对数值为X轴，百分吸光度值为Y轴，绘制标准曲线图。根据样
品百分吸光度值，可从曲线上得到对应点的横坐标，即为磺胺二十合一浓度的对数值，求得
反对数即为测定液中磺胺二十合一浓度C（ppb）
5.1.3由于样品经过了预先稀释，因此根据标准曲线所得出的样品浓度一定要再乘以其稀释
倍数。
5.2 半定量测定
5.1.1目测半定量测定：首先选择一个适当的标准液与样品同运行，根据样品与标准品吸光
度值的高低比较，判断样品浓度值是小于还是大于标准值。
5.1.2仪器半定量测定：首先选择一个适当的标准液与样品同运行，根据样品与标准品颜色
深浅比较，判断样品浓度值是小于还是大于标准值。
6 特异性
物质 交叉反应
磺胺二十合一 100%
磺胺间二甲氧基嘧啶 30%
磺胺嘧啶 10%
磺胺二甲嘧啶 10%
磺胺林 6%
磺胺苯吡唑 5%
磺胺醋酰 2%
磺胺胍 1%
氨苯磺胺 0.2%
磺胺苯甲酰胺 0.03%
7 试剂盒参数
本试剂盒检测下限为0.05ppb
B0吸光度最佳值应大于1.0
试剂盒吸光度板内误差小于8％，板间误差小于15％。
用本说明书提供的组织样本提取方法回收率大于80％。
8 标准曲线模式（仅供参考）
试剂盒提供的标准曲线范围为0.1ppb~8.1ppb 。
9 分析限制
本试剂盒检测为阳性的样品应该用另一种方法如HPLC或GC/MS加以确证。__
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