免疫测定的标准化-抗原的不均一性和交叉反应性
蛋白激素显然是不均一的，其在血液循环中除了有生物学活性形式外，还有前激素、片段和亚单位。副甲状腺素（PTH）、ACTH及其前体、催乳素和促胃液素的大的形式以及生长激素的拼接变异体等均可引起测定问题。使用单克隆抗体的两位点双夹心测定大大改善测定的特异性，例如使用抗绒毛膜促性腺激素的。和p亚单位的单抗建立的双夹心方法将不会测定游离的亚单位。使用针对ACTH或PTH的氨基和羧基末端部分的两个抗体建立的双夹心方法则不会测定无生物学活性的片段。一般情况下，所希望测定的是具有生物学活性的成分，但有时为了某些特定的临床目的，则需要有特异的试验来测定降解产物，如hCG的核心成分。因此，为保证测定的特异性，就不仅要求有具有生物学活性的激素标准晶，而且要有临床上相关的降解产物的标准品。
某些血清蛋白有在等电点上不同（如。1-抗胰蛋白酶）或聚合程度不同（如触珠蛋白）的各种遗传变异体，尽管这些变异体的比例不同会影响其免疫测定的结果，但这并不是血清蛋白免疫测定的突出问题。用于血浆蛋白测定的试验通常使用多克隆抗血清，多克隆抗体测定不了蛋白结构上的微小差异。相反，使用单克隆抗体则有可能测不到某些变异体，这是血清蛋白免疫测定上的一个普遍问题。糖蛋白的不均一性主要在于糖基化尤其是唾液酸含量的差异，唾液酸含量上的差异进而引起蛋白等电点和电泳移动性的差异。抗体通常对这些差异不敏感，因此，糖的不均一性对免疫反应性影响很小。然而蛋白上的糖链可通过修饰或覆盖一个肽决定基而改变蛋白的免疫反应性。相反，黏蛋白的主要抗原决定基则由糖成分所组成。免疫测定实验设计上小的差异也会引起多态性抗原测定结果上较大的差异，黏蛋白抗原CAl25，CAl9-9和CAl5-3的测定可以很明确的证明这一点。例如，由不同组织产生的CAl5-3含有不同数量的20个氨基酸的串联重复序列，而试验中测定抗原所用的单抗是用肿瘤细胞制备的，因而所测定的抗原是结构不太明确的大分子。尽管大多数试剂厂家均使用相同的标准品和抗体，但其相互之间的相关性很差，这很可能是由于在实验设计上的差异所致，因此每一种方法都应有其各自的参考范围值。