福尔马林固定时，组织中的许多氨基酸残基在分子内或分子间形成了醛键，使得不少抗原决定簇被封闭。同时，由于甲醛的聚合作用，使蛋白质分子间相互交联形成大分子网络，也导致了抗原决定簇被掩盖，这就使得相当部分的抗原不能与抗体很好是进行反应。因此，抗原修复也是影响免疫组化染色结果的基本因素。
在传统标准方法,经脱蜡、脱水和用3%H2O2阻断内源性过氧（化）物酶，石蜡切片经蒸馏水冲洗，放置在塑料Coplin缸中。加入AR液，如蒸馏水、缓冲液、金属盐液、尿素等，盖上并置家用微波炉加热5或10分钟（注意防止切片干躁）。有时在加热5分钟后，间隔1分钟，再加热5分钟（在第一个5分钟后检测液体高度）。加热后，从微波炉取出塑料Coplin缸，冷却15分钟。片子经蒸馏水冲洗二次后在PBS液中浸5分钟，才进行IHC染色。为了保持一致的加热条件，必须设定靠近微波炉中心相同的位置及同一编号的Coplin缸 ，按照不同的抗体设定不同的加热时间，尽可能的建立标准的加热条件。
Shin等人[5]发展了含水高压锅煮沸方法，来增强福尔马林固定的脑组织tau蛋白免疫反应性。将切片连同柠檬酸缓冲液放入高压锅内，加热至产生喷气，并持续2min，压力锅离开热源，加热长短的控制很重要，从组织切片放入缓冲液到高压锅到压力锅离开热源总时间在5-8分钟，时间过长可能会使染色背景加深。现试剂公司提供的大多数抗体都建议使用高压锅煮沸方法，这几年的实践表明，采取此方法可避免假阳、阴性，使IHC染色效果更佳。
非加热AR技术包括酶消化、酸水解等方法。目前，主要是酶消化，酶消化是以化学的方法来打断醛键，修复抗原。
总之,以高压加热方法、微波加热方法较为稳定, 高压加热方法效果优于微波加热方法和单纯加热方法。溶液的浓度对修复效果无任何影响，而PH值则影响较大。缓冲液以柠檬酸缓冲液和Tris-HCL较常用。前人的研究表明，温度高修复时间短[6]。解放军第251医院根据临床病理诊断、鉴别诊断和研究的实际需要，在抗原修复方法规范研究和应用的基础上，创用了胰蛋白酶—尿素联合消化技术、盐酸水解暴露抗原技术和MW—表面活性剂Triton X—100（MW—TX）修复抗原技术 [7] 。抗原暴露或抗原修复方法较多，其中发MW—枸橼酸缓冲液使用较多，效果最好。MW修复抗原的方法是石蜡切片脱蜡、水洗后放入修复液中，用250W的输出功率2X5min，待冷却至室温按常规处理。目前AR过程已成功应用在BioTek全自动免疫组化染色仪中。
加热持续时间和强度是重要的影响因素之一，AR液的PH值、浓度、化学成分也是重要的影响因素之一。使用低PH值AR液必须使用阴性对照片，以防止定位不准[9]。Shi等人[10]强调修复缓冲液的PH值对某些抗原的修复十分重要,实验中我们也发现要获得满意结果必须选择抗原修复液的最适PH值。在常规石蜡切片做AR-IHC，采用不同浓度的Alcl3液做AR液，发现4%的Alcl3取得最理想的染色[11]。在修复的抗原中，金属盐可影响蛋白的结构。郑辉等人[12]使用0.01mmol/LPBS、0.01mol/L柠檬酸缓冲液、0.1mol/L Tris-HCL缓冲液及1mmol/L EDTA-Na2，于微波修复抗原，发现其阳性强度逐渐增强。
高温抗原修复因其机理相当复杂，对某些存在的问题很难用设计对照的方法加以解决，有些抗体在冰冻切片上呈阴性反应，但在石蜡切片用抗原修复后却能很好的显示。对某些应表达在胞浆或表达在核内的抗原，经过量修复后，绝大部分表达在核内，例如，P185、Bcl-2、P-gp、Nm23，而有些表达在核内的抗原经过量修复会出现在胞浆内，例如P53、PcNA、Ki-67等[6]。在使用该方法时一定小心，对结果的判断也要客观地作出分析，侯宁等人发现端粒酶逆转录酶（TRT）经过抗原修复与不经过抗原修复，其染色效果明显不同，后者的阳性率明显高于前者[8]。
操作中还应注意如下问题：
6、如果在常用的缓冲液中无法实现抗原修复，或经修复后抗原定位发生改变，可改用一些不常用的缓冲液，或加一些螯合剂，如EDTA等可改善某些抗原的修复。
用于IHC消化的酶很多，所选酶的种类，使用的浓度，PH值，消化时间及温度等均要视组织固定的不同，所检测抗原的性质、组织类型的不同而异，应通过预实验摸索确定。使用酶消化的原则：胰蛋白酶和蛋白酶K一般用于细胞内抗原，如Keratin，CEA，GFAP等。胃蛋白酶则主要用于细胞间质抗原的检测，如fibronectin，Laminin，各型胶原等。一般来言，消化时间和组织固定的长短呈正比。在用酶消化，热修复后均不能获得结果的前提下使用抗原修复与酶消化结合的方法，有时会取得较为满意的结果。一般蛋白酶K和微波相结合，但应注意，可能检测的抗原无论何种性质均会在核内出现假阳性反应[6]。
上个世纪九十年代早期，随着AR技术的发展，IHC应用在常规处理火胶棉包埋的人类颞骨上，从分子水平上了解人类发病机理和病理生理学，创立了一个新的领域[13]。使用AR方法，在常规处理石蜡切片上评估IC5和ID15单克隆抗体的免疫组化染色[14]。 Charalambous. C等人 [15]强烈推荐MW-AR-IHC方法检测R-S细胞的CD30。AR技术成功应用于原位杂交[16]。利用加热AR-IHC技术，在福尔马林固定、石蜡组织切片上用抗毒素#4350检测nestin[17]。采用抗复技术，在人类上皮、神经、神经内分泌组织中免疫组化定位DCC蛋白[18]。AR-IHC已广泛应用于临床的研究中。
AR的标准化和发展
现AR技术已广泛应用于免疫组化（IHC）各领域的研究，例如在诊断病理学和IHC的标准化方面。对原来仅表达在冰冻切片上的抗原，利用AR后绝大部分抗体能用于常规甲醛固定的石蜡切片上，对IHC回顾性研究和临床病理IHC鉴别诊断，肿瘤患者术后的预后检测及疗效评估具有积极的意义。
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