待检的人血清
包被液 洗涤液 磷酸盐-柠檬酸缓冲液 底物溶液 终止液 酶结合物冻存液的母液 应用液
聚苯乙烯微量反应板 酶标检定仪 吸管 橡皮吸头等 检测结核菌抗体的 ELISA 试剂盒

步骤

实验所需「试剂」具体见「其他」

1. 包被抗原

用套有橡皮吸头的 0.2 ml 吸管小心吸取用包被液稀释好的抗原，沿孔壁准确滴加 0.1 ml 至每个塑料板孔中，防止气泡产生，置 37℃ 过夜。

2. 清洗

快速甩动塑料板，倒出包被液。用另一根吸管吸取洗涤液，加入板孔中，洗涤液量以加满但不溢出板孔为宜。室温放 3 min，甩出洗涤液。再加洗涤液，重复上述操作三次。

3. 加血淸

用三根套有橡皮吸头的 0.2 ml 吸管，小心吸取稀释好的血淸（待检、阳性、阴性血清），准确加 0.1 ml 于对应板孔中，第 4 孔中加 0.1 ml 洗涤液，37℃ 放置 10 min 在水池边甩出血清，洗涤液洗三次（方法同上）。

4. 加酶标抗体

用吸管沿孔壁上部小心准确加入 0.1 ml 酶标抗体（不能让血清沾污吸管），37℃ 放置 10 min，同上倒空，洗涤三次。

5. 加底物

按比例加 H2O2 于配制的底物溶液中，立即用吸管吸取此种溶液，分别加于板孔中，每孔 0.1 ml。 置 37℃，显色 5～15 min（经常观察），待阳性对照有明显颜色后，立即加一滴 2 mol/L H2SO4 终止反应。

6. 判断结果

肉眼观察（白色背景），阳性对照孔应明显黄色，阴性孔应无色或微黄色，待测孔颜色深于阳性对照孔则为阳性；若测光密度，酶标测定仪取 λ=492nm，P/n＞2.1 时阳性，P/n＜1.5 阴性，2.1＞P/n＞1.5可疑阳性，应予复査，P/n=(检测孔 O.D. 值)/(阴性孔 O.D. 值)（用空白孔校 T=100％）。

滴加试剂量要准，且试剂不可从一孔流到另一孔中，每种试剂对应一种吸管，不能混淆，底物溶液中的 H2O2 要临时用再加。否则，放置时间过长，底物被氧化为黄色，影响试验结果判定。

注意事项

在操作过程中切记溢出互混。

常见问题

试剂：

1. 包被液（0.05 mol/L pH 9.6 碳酸盐缓冲液）：甲液：Na2CO3，5.3 g/L，乙液：NaHCO3，4.2 g/L，取甲液 3.5 份加乙液 6.5 份混合即成，现用现混。

2. 洗涤液（吐温酸盐缓冲液 pH 7.4）：NaCl 8 g，KH2PO4 0.2 g，Na2HPO4·12 H2O 2.9 g，KCl 2 g，吐温 20 0.5 ml，蒸馏水加至 100 ml。

3. pH 5.0 磷酸盐-柠檬酸缓冲液：柠檬酸（19.2 g/L）24.3 ml，0.2 mol/L 磷酸盐溶液（28.4 g Na2HPO4/L）25.7 ml 两者混合后再加蒸馏水 50 ml。

4. 底物溶液：100 ml pH 5.0 磷酸盐—柠檬酸缓冲液加邻苯二胺 40 mg 用时再加 30％ H2O2，0.2 ml。

5. 终止液 2 mol/L H2SO4。

6. 酶结合物冻存液的母液：0.02mol/L PBS pH 7.4，即（1）K2HPO4·3H2O 1.83 g 加蒸馏水至 400 ml，（2）Na2HPO4·2H2O，312 g，加蒸饱水至 100 ml，（1）：（2）＝81：19 混合。

7. 应用液：0.02mol/L PBS pH 7.4，60 ml＋40 ml 甘油＋万分之一的疏柳汞（也可不加）配成 40％ 甘油液，即为酶结合物冻存液。