提供者：上海劲马实验设备有限公司 发布时间：2012/10/19 15:25:19 阅读次数：3243次 进入该公司店铺
RT - PCR法不仅可以用来检测特定基因也semi-quantitate水平。因此，一个可以比较转录水平在不同的样品。这可以通过不同的方式。一是定量反转录水平从控制，看家基因（如肌动蛋白和）。（转录的看家基因被认为是受了几乎所有的实验条件。）另一种方法是添加一个引物特异性聚合酶链反应在反应外源性，模板。
量化对看家基因转录
该方法包括逆转录使用寡核苷酸引物和随机引物。由此产生的基因从而代表两个看家基因转录以及具体的成绩单是量化。逆转录反应然后放大在一个对聚合酶链反应系列-一系列放大看家基因（用磷酸甘油醛脱氢酶，等等，特异性引物），和其他的特定基因的兴趣（在不同的基因，利用基因特异性引物）。
不同的聚合酶链反应管内的每一个系列的建立等，他们在不同的数额模板（金额逆转录反应产物[基因]）或进行聚合酶链反应扩增循环数不同。这是因为，聚合酶链反应扩增，虽然理论上对数，不太高或低数量扩增周期。对数和指数扩增通常只发生在中东的周期，这取决于浓度目标模板。比较因此可以只在这一阶段。
聚合酶链反应后，同体积的反应产物的电泳琼脂糖凝胶上（最好是在同一凝胶）。图像的彩色脱氧核糖核酸（产物）然后获得和分析的视觉比较或与计算机软件（如图像论文）。一个例子是如下，半定量的目视检查是表达fut9基因在细胞系，lec12和lec29
可以看出，1）两个细胞系，指数扩增两型和fut9发生在周期33 - 42。2）本型带强度在这些周期表明几乎相同水平的模板（基因）是用于什么细胞系。3）的fut9水平约6 - 9周期＇behind ＇ ＇ lec12比lec29。
注释
1。应该做一个试点实验，首先是要确保只有单一的，具体的产品获得的引物，得到一个想法的一系列周期或逆转录反应稀释使用。
2。一开始应该与等量的核糖核酸聚合酶反应。
3。所有的反应进行的同时，使用试剂，准备作为一个supermix减少任何变化。
4。产物应该是运行在同一凝胶，再减少任何变化。
5。当定量比较罕见的成绩单，它可以更好地用于控制那些看家基因的转录本在一个较低的水平。例如，誊醛缩酶表示在一个较低的水平相比，基因。
6。当进行聚合酶链反应不同周期数，建立聚合酶链反应的反应，消除他们一点零一分在中东的扩展阶段期间所需的聚合酶链反应循环数。然后放在水浴在65～75℃几分钟保证延伸完成。
7。当反应不同反应量（通常是一个系列的2或3倍稀释），稀逆转录反应使用逆转录反应，没有模板的不同反应的反应有相同数量的反应（但不同数量的基因）。这是必要的，因为成分比其他基因的逆转录反应（如逆转录，数码地面电视，等）可以影响反应效率。
半定量使用外源性标准
一个可以有外源性标准（无论是核糖核酸或核酸），可以被放大使用相同的引物，扩增转录的兴趣。本标准的目的是有相同的序列的转录兴趣除了是40 - 50个核苷酸短或更长。不同数量的标准是用来在不同的聚合酶链反应的反应（如标准是一种核糖核酸，它是前加入逆转录步骤）和扩增相同数量的周期。外源性标准竞争与内源性模板，因此，这个策略也被称为竞争性RTP CR。
产品electophoresed和定量的软件和一个标准的＇amount ＇ ＇与＇强度＇ ＇ ＇band绘制。
在这个例子中所示，产品1是从标准和2是由内源性转录。可以看出，数额标准加入的反应为5道大致等于转录量。
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