最确定的方法是直接标记一抗。例如，当应用针对不同抗原的两种特异性纯化单抗时，将其中一种标记FITC，另一种标记Texas红。只要这两种单抗本身适合进行荧光标记，一般均会得到满意的结果。

第二种方法是应用两套种属、类或亚类特异性的检测试剂。例如，使用针对不同抗原的多克隆兔抗体和小鼠单抗时，就可以应用FITC标记的羊抗兔免疫球蛋白抗体和Texas红标记的羊抗小鼠免疫球蛋白抗体对之进行研究。在这些方案中，必须严格检查抗兔免疫球蛋白抗体的种属特异性。在上例中，羊抗兔抗体不能识别小鼠单抗的任一表位，反之亦然。由于一些公司生产的此类产品已检测了这种特性，使得实现以上要求变得更为容易。另一种避免影响结果的方法是利用与另一种一抗来源相同的动物产生的二抗，例如，细胞染色时选用的2种一抗分别来源于小鼠和兔，这时标记二抗可以选用小鼠抗兔和兔抗小鼠抗体，并用不同荧光染料标记，由于一种动物不会对自身抗体产生抗体，所以避免了交叉反应的发生。

第三种方法，亦是最少应用的方法，即相继采用染色反应。应用该方法必须特别注意避免细胞离散或重叠。在步骤间采用固定可解决该问题，但是使实验时间延长。

在以上3种方法中都必须特别注意双重标记试剂的选择，确保无交叉反应，这通常要设立对照反应以进一步验证。