随着荧光检测的普及，许多研究人员正考虑将western blot的检测方法从化学发光转到多重荧光。这一趋势背后有多个推动力。最重要的是，荧光检测能够实现多重western blot分析，每次能够同时检测几个目标蛋白，而不再需要剥离和重新杂交。荧光的其他好处在于动态范围更宽、信号稳定性更好。
荧光blotting
• 抗体浓度应当优化，在几种不同稀释度的抗体中孵育膜。选择信噪比最高的稀释度。
• 从化学发光转到荧光检测时，一抗浓度应当增加；通常来说是增加2-5倍。二抗浓度可能也需要优化；1:5,000稀释是个不错的起点。在使用特定抗体时，可以参照生产商的建议。
• 为了让信噪比最高，应使用自发荧光低的膜，如 Immun-Blot® low fluorescence （LF） PVDF membrane。
• 许多封闭液都成功用于荧光检测。我们建议使用0.5-5% 酪蛋白、最多5%的脱脂奶粉，或最多3% BSA，溶于TTBS中。
• 缓冲液中的颗粒可能停留在膜上，并造成荧光假象。只使用高质量的试剂，并对所有缓冲液过滤灭菌。
• 使用钝的镊子从边缘操作。避免划破膜或弄皱，这会在荧光检测时造成假象。
• 使用铅笔来标记膜，因为许多墨水都会发出荧光。
• 溴酚蓝会发出荧光。确保染料与样品已分开，切掉凝胶上包含染料的部分，或省掉样品缓冲液中的溴酚蓝。
• 无需在暗处开展免疫检测；正常的室内灯光不会使荧光标记的抗体发生光漂白。不过，荧光标记抗体的储液应保存在暗处。
• 在处理膜时，使用无粉末的手套，以避免膜上出现假象或指纹。
多重分析
• 使用来自不同宿主的一抗（如小鼠和兔）。两个亲缘关系相近物种的抗体（如大鼠和小鼠）通常会造成交叉反应，即使抗体已经过交叉吸附。
• 使用经过交叉吸附的二抗，以避免交叉反应。
• 使用光谱上不同的荧光基团偶联物，避免交叉通道荧光。
• 在同时检测多个目标之前，单独优化每个目标的检测。由于一些一抗并非很特异，在膜上会产生多条带，故多重实验之前的单目标检测将有助于确定每个抗体的条带模式。
• 大部分膜在波长较短的激发光下会显示出较高的背景。记住，在蓝色通道检测最强的目标，在绿色通道检测中等目标，而保留红色通道来检测最弱的目标。
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