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如何分离血清脂蛋白
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上 传 者：杰辉生物（北京）科技发展有限公司
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如何分离血清脂蛋白
1. NaBr 梯度液的配置：
● 必须用极干燥的分析纯NaBr。NaBr晶体使用前在210℃烘箱中过夜，取出后储存在干燥器中
● 配置密度：1.006g /ml，9g/l
1.016g /ml，27g/l
1.063g /ml，95g/l
1.210g /ml，283.4g/l
1.368g /ml，524.8g/l
● 配置NaBr用溶剂0.05％EDTA（PH7.0），使用前EDTA必须过滤，储存在褐色瓶中，4℃，使用前要析测密度（用阿贝折射仪或其他恒温折射仪（浓度－密度配置表见后）
2. 分离步骤：
Ⅰ. 去除血细胞：1000xg，20分
Ⅱ. 去除乳糜粒（见技术讲座文献）
Ⅲ. 用血清/1.386g/m溶液=1:4的比例混合分离用样品液
（例：P40ST水平转头用0.2ml血清加0.8ml 1.386g/ml，NaBr液；P35ZT区带离心转头用200ml血清加800ml 1.386g/ml NaBr液）
Ⅳ. 梯度铺设：如果用13ml离心管，则底部加1ml混合样品液，然后依次向上分层铺设：3.2ml，1.21g/ml NaBr；3.8ml 1.063g/ml NaBr液；3.3ml，1.016g/ml NaBr液；1.2ml 1.006g/ml NaBr液。
如果用P35ZT区带转头则先从转头外测从低密度到高密度依次加入1.006，1.016，1.063，1.21梯度液最后加入样品混合液，参考容量依次为74ml，193ml，228ml，195ml及1000ml。
3. 离心工艺：
● P40ST转头：38,500rpm（263,000xg），24hrs，14℃，加速“8”，减速“7”
● P35ZT区带转头：35,000rpm（122,000xg），49hrs，14℃
4. 样品收集：
● P40ST转头：离心后可以用手工收集也可以用日立DGF－U（密度梯度制备－收集仪），手工收集每管（13ml）收集或40管，分别测O.D.值（280mm及260mm）绘出O.D.－管数值曲线。根据各峰顶对应位置可以找到各种密度脂蛋白所在管。
用DGF－U收集时将抽出管联接到带流动池的分光光度计，流动池连续测量O.D.，并在记录仪上绘出O.D.－管数的连续曲线。再根据O.D.峰对应位置找到各种密度脂蛋白所在管。
● P35ZT转头：用Masterflex管道泵将40％w/w NaBr液体从转头外测连续泵入转头，中心管接到分光光度计流动池，从中心管排出的样品连续测定O.D.，并在记录仪上绘出O.D.－管数曲线，一般根据需要可以收集成50－100管，和P40ST同样方法决定各种不同密度脂蛋白所在管。
5. 结果：用P40ST转头分离纯化收集后各种密度脂蛋白分布如下：
| 脂蛋白分类 | 管序数 | 从管上液面向下计算的毫升数 |
| VLDL | 1－5 | 0.5－1.0 |
| IDL | 6－9 | 1.5－2.0 |
| LDL | 10－18 | 2.5－4.5 |
| HDL1 | 20－24 | 5.0－6.0 |
| HDL2 | 25－34 | 6.8－8.5 |
| HDL3 | 35－38 | 9.0－10.0 |
用P35ZT分离的结果可根据峰位置决定管序数
6. 讨论：可分别测A260与A280，根据A280/A260比值可估计蛋白质纯度，如果某个峰值A280/A260≈1.8，说明蛋白质较纯。
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